Summary

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים<em> במבחנה</em

Published: January 11, 2017
doi:

Summary

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

Abstract

מחקרים של חלבונים בממברנה נפרדים במבחנה מסובך לעתים קרובות על ידי הנוכחות של תחום הטרנסממברני הידרופובי. שמסבך עוד יותר את המחקרים הללו, reincorporation של חלבונים בממברנה דטרגנט-solubilized לתוך ליפוזומים הוא תהליך סטוכסטיים שבו טופולוגיה חלבון אי אפשר לאכוף. מאמר זה מציע שיטה חלופית לטכניקות מאתגרות אלו אשר מנצלות פיגום מבוסס liposome. מסיסות חלבון מוגברת על ידי מחיקה של תחום הטרנסממברני, וחומצות אמינו אלה מוחלפים עם מחצית קשירה, כגון תג שלו. לקשור זה אינטראקציה עם קבוצת עיגון (Ni 2 + מתואם על ידי חומצה nitrilotriacetic (נ.ת.ע (Ni 2 +)) עבור חלבונים שלו מתוייגים), אשר כופה טופולוגיה חלבון אחידה על פני השטח של liposome. דוגמה מוצגת שבה האינטראקציה בין הקשורה Dynamin חלבון 1 (Drp1) עם חלבון ממברנלי אינטגרלי, פקטור ביקוע מיטוכונדריאלי (MFF), היה investigated בשיטה ליפוזום פיגום זה. בעבודה זו, אנו הדגמנו את היכולת של MFF לגייס מסיסי Drp1 ביעילות אל פני השטח של ליפוזומים, אשר עורר פעילות GTPase שלה. יתר על כן, Drp1 הצליח tubulate תבנית השומנים המעוטר MFF בנוכחות שומנים ספציפיים. דוגמא זו ממחישה את האפקטיביות של ליפוזומים פיגום באמצעות מבחנים מבניים ותפקודיים ומדגישה את תפקיד MFF בהסדרת פעילות Drp1.

Introduction

לימוד אינטראקציות קרום הפרוקסימלי חלבונים הוא מאמץ מאתגר בשל קושי משחזר את הסביבה הטבעית של חלבונים בממברנה נפרדים המעורבים 1. זאת בשל הצורך של solubilization דטרגנט ואת הכיוון הלא סדירה של חלבונים proteoliposomes. על מנת למנוע בעיות אלה, יש לנו עובדים אסטרטגיה לפיה תחומים מסיסים של חלבונים בממברנה נפרדים מבוטאות חלבוני היתוך התג שלו, ושברי מסיסים אלה מעוגנים ליפוזומים פיגום באמצעות אינטראקציות עם נת"ע (Ni 2 +) headgroups על השומנים משטח. באמצעות פיגומים אלה, אינטראקציות חלבון-הפרוקסימלי שומנים יכולות להיחקר על פני טווח של קומפוזיציות שומנים וחלבונים.

יש לנו ליישם ביעילות בשיטה זו כדי לחקור את יחסי הגומלין בין חלבונים הקריטיים השולטים הרכבה של מתחם ביקוע המיטוכונדריה ולבחון אינטראקציות שומנים לווסת pr זהocess 2. במהלך ביקוע המיטוכונדריה, חלבון שיפוץ קרום משומר, שנקרא הקשורה Dynamin חלבון 1 (Drp1) 3, מגויסת אל פני השטח של הממברנה החיצונית מיטוכונדריאלי (OMM) בתגובה לאותות הסלולר המווסתים הומאוסטזיס אנרגיה, איתות אפופטוטיים, וכמה אחרים תהליכי המיטוכונדריה נפרדים. GTPase גדול, cytosolic זה גייס אל פני השטח של המיטוכונדריה דרך אינטראקציות עם חלבונים OMM אינטגרלי 4 8. תפקידו של חלבון אחד כזה, פקטור ביקוע מיטוכונדריאלי (MFF), כבר קשה להבהיר עקב אינטראקציה חלשה לכאורה עם Drp1 במבחנה. אף על פי כן, מחקרים גנטיים הראו בבירור כי MFF חיונית 7,8 ביקוע המיטוכונדריה מוצלח. השיטה המתוארת בכתב היד הזה הייתה מסוגלת להתגבר על חסרונות קודמים על ידי החדרת אינטראקציות שומנים סימולטני המקדמות אינטראקציות Drp1-MFF. בסך הכל, revea assay הרומן הזההובל כוחות יסוד המנחים הרכבה של מתחם ביקוע המיטוכונדריה וספק שלב חדש ללימודי מבניים ותפקודיים מתמשכים של מכונה מולקולרית חיונית זה.

נכון להיום, בחינת יחסי הגומלין בין Drp1 ו MFF כבר מסובך בגלל הגמישות המובנית של MFF 9, ההטרוגניות של Drp1 פולימרים 2,10, והקושי מטהרים reconstituting באורך מלא MFF עם תחום הטרנסממברני שלם 11. טיפלנו אתגרים אלה באמצעות נ.ת.ע (Ni 2 +) ליפוזומים פיגום כדי לשקם MFF מתויג שלו חסר תחום הטרנסממברני שלה (MffΔTM-שלו 6). אסטרטגיה זו הייתה יתרון משום MffΔTM היה מסיס מאוד כאשר ביטוי יתר ב E. coli, וחלבון מבודד זה היה מחדש בקלות על ליפוזומים הפיגום. כאשר קשור לתבניות השומנים האלה, MFF להניח אוריינטציה זהה, פונים כלפי חוץ על פני הממברנה.בנוסף יתרונות אלה, שומנים המיטוכונדריה, כגון cardiolipin, נוספו לייצב מתקפלים וההתאגדות MFF עם קרום 11. Cardiolipin גם אינטראקציה עם התחום המשתנה של Drp1 2,12 אשר עשוי לייצב באזור המופרע הזה ולהקל הרכבה של מכונות הביקוע.

שיטה חזקה זו ישימה נרחב למחקרים עתידיים המבקשים להעריך אינטראקציות חלבון-הפרוקסימלי הממברנה. באמצעות שימוש אינטראקציות קשירה / זיקה נוספות, התחכום של מחקרי כינון מחדש קרום אלה ניתן לשפר כדי לחקות מורכבות נוספת נמצאת על פני השטח של ממברנות בתוך תאים. במקביל, קומפוזיציות שומנים ניתן לשנות באופן מדויק יותר לחקות את סביבות יליד מתחמי macromolecular אלה. לסיכום, שיטה זו מספקת אמצעי לבחינת התרומה היחסית של חלבונים ושומנים בעיצוב מורפולוגיות הממברנה במהלך proc הסלולר הקריטיesses.

Protocol

1. הכנת Liposome פיגום הערה: באופן אידיאלי, ניסויים ראשוניים צריכות להשתמש פיגום פשוט חסר ייחוד יחסית (מורכב dOPC (1,2-dioleoyl- SN -glycero-3-phosphocholine או PC) DGS-נ.ת.ע (Ni 2 +) (1,2-dioleoyl – SN -glycero-3 – [(N – (5-אמינו-1-carboxypentyl) חומצת iminodiacetic) succinyl]. (מל?…

Representative Results

בעוד האינטראקציה בין Drp1 ו MFF הודגמה להיות חשוב לביקוע המיטוכונדריה, אינטראקציה זו כבר קשה לשחזר במבחנה. מטרתנו הייתה לחקות את הסביבה התאית טוב יותר שבו Drp1 ו MFF אינטראקציה. לשם כך, ליפוזומים המכילים ריכוזים הגבלת נת"ע (Ni 2 +) headgroups הוכנו …

Discussion

פרוטוקול זה מציע שיטה לחקירת אינטראקציות בין חלבונים מעורבים חלבונים בממברנה נפרד. על ידי ניצול פיגום ליפוזום מודולרי, חוקרים מסוגלים להעריך את הפעילות של חלבונים אחד או יותר בסביבת שומנים הפרוקסימלי. מחקרים קודמים הוכיחו בשיטה דומה עבור אנזימי קולטן של קרום הפלזמ?…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to acknowledge the funding received from the American Heart Association (SDG12SDG9130039).

Materials

Phosphatidylcholine (DOPC) Avanti Polar Lipids 850375
Phosphatidylethanolamine (DOPE) Avanti Polar Lipids 850725
DGS-NTA(Ni2+) Avanti Polar Lipids 790404
Bovine Heart Cardiolipin (CL) Avanti Polar Lipids 840012
Chloroform Acros Organics 268320010
Liposome Extruder Avanti Polar Lipids 610023
Cu/Rh Negative Stain Grids Ted Pella 79712
Microfuge Tube Beckman 357448
GTP Jena Biosciences NU-1012
GMP-PCP Sigma Aldrich M3509
Microtiter Plate strips Thermo Scientific 469949
EDTA Acros Organics 40993-0010
Instant Blue Coomassie Dye Expedeon ISB1L
HEPES Fisher Scientific BP310
BME Sigma Aldrich M6250
KCL Fisher Scientific P330
KOH Fisher Scientific P250
Magnesium Chloride Acros Organics 223211000
4-20% SDS-PAGE Gel Bio Rad 456-1096
4x Laemmli Loading Dye Bio Rad 161-0747
HCL Fisher Scientific A144S
Malachite Green Carbinol Sigma Aldrich 229105
Ammonium Molybdate Tetrahydrate Sigma Aldrich A7302
Laboratory Film Parafilm PM-996
Uranyl Acetate Polysciences 21447
Tecnai T12 100 keV Microscope FEI
Optima MAX Beckman
TLA-55 Rotor Beckman
Refrigerated CentriVap Concentrator Labconico
Mastercycler Pro Thermocycler Eppendorf
VersaMax Microplate reader Molecular Devices

Referenzen

  1. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta (BBA) – Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  2. Clinton, R. W., Francy, C. A., Ramachandran, R., Qi, X., Mears, J. A. Dynamin-related Protein 1 Oligomerization in Solution Impairs Functional Interactions with Membrane-anchored Mitochondrial Fission Factor. J Biol Chem. 291 (1), 478-492 (2016).
  3. Chan, D. C. Mitochondrial Fusion and Fission in Mammals. Annual Review of Cell and Dev Biol. 22 (1), 79-99 (2006).
  4. Bui, H. T., Shaw, J. M. Dynamin Assembly Strategies and Adaptor Proteins in Mitochondrial Fission. Curr Biol. 23 (19), R891-R899 (2013).
  5. Elgass, K., Pakay, J., Ryan, M. T., Palmer, C. S. Recent advances into the understanding of mitochondrial fission. Biochim Biophys Acta (BBA) – Mol Cell Res. 1833 (1), 150-161 (2013).
  6. Losón, O. C., Song, Z., Chen, H., Chan, D. C. Fis1, Mff, MiD49, and MiD51 mediate Drp1 recruitment in mitochondrial fission. Mol Biol Cell. 24 (5), 659-667 (2013).
  7. Otera, H., Wang, C., et al. Mff is an essential factor for mitochondrial recruitment of Drp1 during mitochondrial fission in mammalian cells. J Cell Biol. 191 (6), 1141-1158 (2010).
  8. Gandre-Babbe, S., van der Bliek, A. M. The Novel Tail-anchored Membrane Protein Mff Controls Mitochondrial and Peroxisomal Fission in Mammalian Cells. Mol Biol Cell. 19 (6), 2402-2412 (2008).
  9. Koirala, S., Guo, Q., et al. Interchangeable adaptors regulate mitochondrial dynamin assembly for membrane scission. Proc Natl Acad Sci. 110 (15), E1342-E1351 (2013).
  10. Macdonald, P. J., Stepanyants, N., et al. A dimeric equilibrium intermediate nucleates Drp1 reassembly on mitochondrial membranes for fission. Mol Biol Cell. 25 (12), 1905-1915 (2014).
  11. Macdonald, P. J., Francy, C. A., et al. Distinct Splice Variants of Dynamin-related Protein 1 Differentially Utilize Mitochondrial Fission Factor as an Effector of Cooperative GTPase Activity. J Biol Chem. 291 (1), 493-507 (2016).
  12. Bustillo-Zabalbeitia, I., Montessuit, S., Raemy, E., Basañez, G., Terrones, O., Martinou, J. -. C. Specific Interaction with Cardiolipin Triggers Functional Activation of Dynamin-Related Protein 1. PLoS ONE. 9 (7), (2014).
  13. Francy, C. A., Alvarez, F. J. D., Zhou, L., Ramachandran, R., Mears, J. A. The Mechanoenzymatic Core of Dynamin-Related Protein 1 Comprises the Minimal Machinery Required for Membrane Constriction. J Biol Chem. 290 (18), 11692-11703 (2015).
  14. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
  15. Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P., Zare, R. N. Rapid preparation of giant unilamellar vesicles. Proc Natl Acad Sci. 93 (21), 11443-11447 (1996).
  16. Klingler, J., Vargas, C., Fiedler, S., Keller, S. Preparation of ready-to-use small unilamellar phospholipid vesicles by ultrasonication with a beaker resonator. Anal Biochem. 477, 10-12 (2015).
  17. Mears, J. A., Hinshaw, J. E. Chapter 13 Visualization of Dynamins. Methods Cell Biol. 88, 237-256 (2008).
  18. Leonard, M., Doo Song, B., Ramachandran, R., Schmid, S. L. Robust Colorimetric Assays for Dynamin’s Basal and Stimulated GTPase Activities. Methods Enzymol. 404, 490-503 (2005).
  19. Ingerman, E., Perkins, E. M., et al. Dnm1 forms spirals that are structurally tailored to fit mitochondria. J Cell Biol. 170 (7), 1021-1027 (2005).
  20. Fröhlich, C., Grabiger, S., et al. Structural insights into oligomerization and mitochondrial remodelling of dynamin 1-like protein. EMBO J. 32 (9), 1280-1292 (2013).
  21. James, D. I., Parone, P. A., Mattenberger, Y., Martinou, J. -. C. hFis1, a Novel Component of the Mammalian Mitochondrial Fission Machinery. J Biol Chem. 278 (38), 36373-36379 (2003).
  22. Yoon, Y., Krueger, E. W., Oswald, B. J., McNiven, M. A. The Mitochondrial Protein hFis1 Regulates Mitochondrial Fission in Mammalian Cells through an Interaction with the Dynamin-Like Protein DLP1. Mol Cell Biol. 23 (15), 5409-5420 (2003).
  23. Osellame, L. D., Singh, A. P., et al. Cooperative and independent roles of Drp1 adaptors Mff and MiD49/51 in mitochondrial fission. J Cell Sci. 129 (11), 2170-2181 (2016).
  24. Esposito, E. A., Shrout, A. L., Weis, R. M. Template-Directed Self-Assembly Enhances RTK Catalytic Domain Function. J Biomol Screen. 13 (8), 810-816 (2008).
  25. Shrout, A. L., Esposito, E. A., Weis, R. M. Template-directed Assembly of Signaling Proteins: A Novel Drug Screening and Research Tool. Chem Biol Drug Des. 71 (3), 278-281 (2008).
  26. Celia, H., Wilson-Kubalek, E., Milligan, R. A., Teyton, L. Structure and function of a membrane-bound murine MHC class I molecule. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 96 (10), 5634-5639 (1999).
  27. Li, E., Wimley, W. C., Hristova, K. Transmembrane helix dimerization: Beyond the search for sequence motifs. Biochim Biophys Acta (BBA) – Biomembranes. 1818 (2), 183-193 (2012).
  28. Zhang, F., Crise, B., Su, B., Hou, Y., Rose, J. K., Bothwell, A., Jacobson, K. Lateral diffusion of membrane-spanning and glycosylphosphatidylinositol- linked proteins: toward establishing rules governing the lateral mobility of membrane proteins. J Cell Biol. 115 (1), 75-84 (1991).
  29. Ramadurai, S., Holt, A., Krasnikov, V., van den Bogaart, G., Killian, J. A., Poolman, B. Lateral diffusion of membrane proteins. J Am Chem Soc. 131 (35), 12650-12656 (2009).
  30. Gambin, Y., Reffay, M., et al. Variation of the lateral mobility of transmembrane peptides with hydrophobic mismatch. J Phys Chem. B. 114 (10), 3559-3566 (2010).
  31. Wilson-Kubalek, E. M., Brown, R. E., Celia, H., Milligan, R. A. Lipid nanotubes as substrates for helical crystallization of macromolecules. Proc Natl Acad Sci. 95 (14), 8040-8045 (1998).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Clinton, R. W., Mears, J. A. Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro. J. Vis. Exp. (119), e54971, doi:10.3791/54971 (2017).

View Video