Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.
Identifiseringen av funksjonelle driver hendelser i kreft er sentralt for å fremme vår forståelse av kreft biologi og uunnværlig for oppdagelsen av den neste generasjonen av romanen narkotika mål. Det blir tydelig at mer komplekse modeller av kreft er nødvendig for å få fullt utbytte av de medvirkende faktorene som driver tumorigenesis in vivo og øke effekten av nye behandlingsformer som gjør overgangen fra prekliniske modeller for å kliniske studier.
Her presenterer vi en metode for generering av ensartede og reproduserbare kreft kuler som kan bli utsatt for siRNA funksjonell screening. Disse sfæroider vise mange egenskaper som er funnet i solide svulster som ikke finnes i tradisjonelle to-dimensjon kultur. Vi viser at flere vanlige brystkreftcellelinjer er mottagelig for denne protokollen. Videre gir vi proof-of-prinsippet data ved å benytte brystkreft cellelinje BT474, bekrefter deresavhengigheten av forsterkning av den epidermale vekstfaktor-reseptor-HER2 og mutasjon av fosfatidylinositol-4,5-bifosfat 3-kinase (PIK3CA) når de dyrkes som tumor sfæroider. Endelig er vi i stand til å undersøke og bekrefte den romlige virkningen av disse avhengig hjelp immunhistokjemi.
Faste tumorer vise signifikant histologisk, genetisk og mikro-miljø intra-tumor heterogenitet, som presenterer klinikere med en betydelig utfordring i å være i stand til å behandle pasienter med hell. De fleste av modellene som brukes til å identifisere nye målrettede behandlingsformer ikke innlemme mange av disse funksjonene. Faktisk har dagens målrettet terapi brukt i klinikken er utviklet i det siste tiåret ansette screening tilnærminger som er avhengige av kreft cellelinjer dyrket under to-dimensjonale (2D) dyrkningsforhold. Selv om dette har ført til en rekke suksesser som reseptor tyrosin kinase hemmere, blir det tydelig at flere komplekse modeller av kreft er nødvendig for å få fullt utbytte av de medvirkende faktorene som driver tumorigenesis in vivo og øke antallet nye behandlingsformer som gjør overgangen fra prekliniske modeller til kliniske studier. Dessuten er det nå godt verdsatt at 2D kultursystemer unnlater å reflektere ivivo oppførsel 1,2. For eksempel, i dårlig vaskularisert svulster, som behovet for oksygen og næringsstoffer i mikromiljøet overgå tilbudet, regioner av høye og lave leveranser utvikle. Nærværet av lave oksygen (hypoksi) i tumorer, som detektert ved immunhistokjemisk farging av tumorsnitt for etablerte hypoksiske markører slik som karbonsyreanhydrase IX (Caix), korrelerer med en dårligere klinisk resultat i brystkreft 3,4 Således omfatter funksjoner såsom hypoksi til screening modeller kan forbedre vår evne til å oppdage nye narkotika mål som vil være mer effektivt in vivo. Faktisk vellykket rettet mot aggressive kreftsvulster som inneholder hypoksi er en klinisk prioritet 5.
Den endring av tradisjonell 2D siRNA screening, i et forsøk på mer nøyaktig å rekapitulere elementer av de vilkår som oppdages av kreftceller i svulsten mikromiljøet, har ført til identifisering av flere gener thpå har blitt funnet å være viktig for tumorvekst in vivo. Disse inkluderer funksjonell genomikk skjermer som utføres under lave serum forhold til 6, hypoksiske forhold 7 og i kombinasjon åtte. For eksempel stanse av 6-Phosphofructo-to-kinase / Fruktose-2,6-Biphosphatase 4 (PFKFB4), et protein ansvarlig for å regulere karbon kommer inn glykolyse, bare indusert apoptose i prostatakreft linjer avledet fra metastaser når dyrket i lav serum. Stanse av PFKFB4 i normale prostatacellelinjer under samme forhold hadde ingen effekt, mens utarming av PFKFB4 helt ablated veksten av prostatakreft cellelinje xenografter 6.
I en utvidet panel av brystkreftcellelinjer, ved å stanse all mono-karboksylase transportør 4 (MCT4) fortrinnsvis ført til reduksjon av cellevekst under betingelser med lav oksygen. Dette sikkerhetsproblemet ble validert in vivo i brystkreftcellelinje ortotrop xenograFTS. Kanskje mest påfallende, tie av acetyl-CoA-syntetase 2 (ACSS2), et enzym som er ansvarlig for konvertering av acetat til acetyl-CoA, redusert kreftcellen nummer under næringsstressbetingelser (lav oksygen og serum), men hadde liten eller ingen effekt under vanlige kulturbetingelser 8. Ablasjon av ACSS2 påvirket veksten av brystkreft og prostatakreft xenografter som tyder på at nærings gradienter ikke eksisterer i isolasjon i svulsten mikromiljøet og at celler som bor i disse regionene er avgjørende for tumorprogresjon 8. Videre ACSS2 ble også funnet å være viktig i glioblastom og levercellekarsinom 9,10, noe som tyder på at økt ACSS2 aktivitet i svulster kan være en grunnleggende mekanisme som støtter vekst under ugunstige forhold.
Sammen er disse studier beviser at recapitulating betingelsene påtreffes in vivo og å utføre siRNA skjermer gjør det mulig å identifisere gEnes avgjørende for overlevelse etter kreft. I tillegg til å påvirke 2D kreft celle vekst under nærings stress forhold, uttømming av målgener i disse studiene hemmet kreft cellelinje spheroid vekst, speiling hva som ble observert i tumorxenotransplantater 6,8. Dermed kreftcellelinje kuler inneholde flere av de forholdene som oppstod i svulsten mikromiljøet som formidler følsomhet for ACSS2 demping. Faktisk, sfæroider vise nærings gradienter (serum og oksygen), endringer i pH, tre-dimensjonal (3D) celle-celle-kontakt, men også, endringer i proliferativ celerity med celler som gjennomgår cellesyklus og apoptose. Dette eksemplifiseres ved tilstedeværelse i kreft kuler av nekrotiske områder, en funksjon som ikke finnes i tradisjonelle 2D kultur.
Kreft celleklumper har allerede blitt brukt som mer biologisk relevante modeller for å skjerme små molekyl hemmere, men dette bare gjør for validering av sammensatte effekt eller gjenbruk av compounds opprinnelig designe for andre sykdommer 11. Nåværende sfæroid screening metoder tillater ikke for analyse av spesifikke gen uttømming i en high-throughput av høyt innhold måte. Her beskriver vi for første gang, en funksjonell genomforskning rørledning for å avdekke spesifikke genet avhengig utnytte små interfererende RNA (siRNA) teknologi i kreftcellelinje kuler. Vi laget et skreddersydd bibliotek med sirnas rettet mot de 200 mest muterte gener i menneske brystkreft og vurdert effekten av genet utarming på spheroid størrelse og metabolsk aktivitet i BT474 brystkreft kuler. Vi var i stand til robust og reproduserbart oppdage effekten av ErbB2 og PIK3CA stanse i 3D kulturer. Videre kan vi vurdere effekten av genet utarming på den romlige arkitektur BT474 kuler ved hjelp av immunhistokjemi.
Tredimensjonale modeller av kreft blir stadig mer brukt for å evaluere effekten av kjente og nye forbindelser som har blitt designet for å selektivt drepe kreftceller. Kreft celleklumper er strukturer som viser forholdene mer lik de møtte i tumorer in vivo, og dermed forbindelser som har økt effekt i 3D er mer sannsynlig å ha en effekt in vivo. Men disse modaliteter ikke tillate identifisering av potensielt nye mål som ikke har vært gjenstand for drug design som kunne ha betydelig effekt i behandling av kreft.
Vi utviklet en siRNA funksjonell genomforskning tilnærming som er tillatt for varig genet Slå i opptil syv dager i kreftcellelinje kuler. Det er flere viktige skritt i protokollen som krever optimalisering før en siRNA skjermen kan utføres. Evnen til å danne reproduserbare levedyktige sfæroider på en stor skala er avgjørende. Dessuten, enppropriate transfeksjon forhold bør nøye optimalisert. Vi foreslår trialing flere forskjellige transfeksjon reagenser med passende ikke-målretting og drepe kontroller før du prøver på skjermen. Vi var i stand til å vise at flere vanlige brystkreftcellelinjer, nemlig BT474, MCF10DCIS.com, MDA-MB-231 og JIMT1 var mottakelig for siRNA transfeksjon. Videre gir vi proof-of-prinsippet data screening de 200 mest muterte gener i brystkreft i BT474 kuler, bekreftet sin avhengighet av forsterkning av HER2 og onkogen mutasjon av PIK3CA. Interessant, stanse av transkripsjonsfaktoren FOXO3 resulterte i en reduksjon i sfæroide størrelse, men ingen signifikant effekt på levedyktigheten. FOXO3 er kjent for å regulere reaksjonen på hypoksi, endring av metabolsk kapasitet av kreftceller som tillater dem å tilpasse seg lettere til sine omgivelser 16. Denne rollen kan potensielt forstyrre cellen levedyktighet lesing som det oppdager ATP overflod, En av de viktigste produktene i celle metabolisme.
Til støtte for observasjon av en reduksjon i sfæroide størrelse, har det vist seg at stanse av FOXO3 i HeLa xenotransplantater nedsatt tumorvekst og induserte apoptose 17. Det er viktig å merke seg at noen gener kan påvirke kapasiteten av kreftceller til å beholde sin 3D-arkitektur, som kan føre til falske positiver. For eksempel, knockdown av E-cadherin resulterte i oppløsning av BT474 sfæroide struktur. Dette hadde tidligere blitt rapportert ved bruk av E-cadherin målrettet antistoffer 18. Som med en hvilken som helst screening plattform, bør potensielle mål bli screenet på nytt for å vurdere reproduserbarheten av den effekt som observeres. Det er begrensninger i teknikk, nemlig forbigående art av siRNA-mediert genet knockdown. Vedvarende tie lenger enn syv dager var ikke oppnåelig med siRNA.
Fordelen med denne tilnærmingen er at den kan kobles sammen med diverse andre biomeTric fargestoffer ikke bare de som vurderer spheroid levedyktighet, for eksempel, gir romlig informasjon spheroid hypoksi eller overvåke celler gjennomgår apoptose. Videre fordi plate leseren skanner er relativt rask og ikke-invasiv, virkningen av siRNAs på spheroid størrelse kan vurderes over tid i stedet for bare på den eksperimentelle endepunktet. Faktisk er vi for tiden utforsker flere av disse veier innenfor vår screening rørledningen. En alternativ tilnærming som benytter 3D-kulturer for å identifisere nye avhengigheter er bruken av kjemiske biblioteker som hemmer enten et bredt spekter av mål eller bestemte familier av proteiner. Faktisk Bitler et al. utnyttet dette målrettet tilnærming til å identifisere den syntetiske dødelighet samspillet mellom ARID1A status og EZH2 hemmere i eggstokkene klare karsinomer 19. Oppdagelsen av CRISPR-Cas9 genet redigering teknologi har også tillatt for utvikling av genetiske skjermer i organoid kulturer og in vivo. Imidlertid thans tilnærming er avhengig av å ha egnede dyrefasiliteter og kan koste prohibitive 20.
I konklusjonen, tror vi at vi har skissert en protokoll som mer nøyaktig modeller oksygen- og nærings graderinger, som er funksjoner av svulsten mikromiljøet in vivo, slik at for identifisering av nye kreft mål eller robust validering av etablerte mål. Videre kan vår protokoll brukes på alle typer cellelinje som danner kuler og dermed kan bli rutinemessig brukt i kreftforskning samfunnet for high-throughput siRNA skjermer.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Fredrik Walberg (FACS and imaging facility, ICR) for assistance with microscopy. This work was funded by Breast Cancer Now. RN is the recipient of a Breast Cancer Now Career Development Fellowship (2011MaySF01).
Lullaby | Oz Biosciences | LL70500 | lipid-based transfection reagent |
Viromer | Lipocalyx | VB-01LB-01 | virus-like polymer transfection reagent |
Ultra-low attachment plate | Corning | CLS7007 | 96 well plate |
Foil plate seals | ThermoFisher | AB-0626 | |
Luminescent cell viability dye | Promega | G7570 | CellTitre-Glo |
Pipette tips (200ul) | Starlab | S1111-0806 | |
Pipette tips (10ul) | Starlab | S1111-3800 | |
Pipette tips (1000ul) | Starlab | S1122-1830 | |
Serological pipettes (5ml) | Sarstedt | 86.1253.025 | |
Serological pipettes (10ml) | Sarstedt | 86.1254.025 | |
Serological pipettes (25ml) | Sarstedt | 86.1685.020 | |
RPMI Media | GIBCO | 11875-093 | |
DMEM Media | GIBCO | 11965-084 | |
Opti-MEM | GIBCO | 31985070 | |
Feta bovine serum | GIBCO | 16140063 | |
siRNA | Dharmacon | Cherry picked library | |
Countess Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | |
Cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10312 | |
Celigo S | Nexcelom | contact company | |
Victor X5 | Perkin Elmer | contact company | |
Benchtop centrifuge | Various | ||
Axiovert Inverted brightfield microscope | Zeiss | contact company | |
Tissue culture C02 Incubator | Various | ||
Mulitichannel pipette | Various |