الاستفادة من علم الجينوم وظيفية الفرز لتحديد أهداف المخدرات رواية يحتمل في الثقافات كروي الخلية السرطانية
Summary
Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.
Abstract
تحديد الأحداث سائق وظيفية في سرطان أمر أساسي لتعزيز فهمنا للبيولوجيا السرطان والتي لا غنى عنها لاكتشاف الجيل القادم من أهداف عقار جديد. أصبح من الواضح أن المزيد من النماذج المعقدة من السرطان يطلب منها أن نقدر العوامل المساهمة التي تدفع تكون الأورام في الجسم الحي، وزيادة فعالية العلاجات الجديدة التي تجعل الانتقال من نماذج ما قبل السريرية إلى التجارب السريرية.
هنا نقدم منهجية لتوليد الأجسام الشبه الكروية الورم موحدة وقابلة للتكرار التي يمكن أن تخضع لفحص وظيفي سيرنا. هذه الأجسام الشبه الكروية تعرض العديد من الخصائص التي توجد في الأورام الصلبة التي ليست موجودة في الثقافة يومين البعد التقليدية. وتبين لنا أن العديد من خطوط خلايا سرطان الثدي شيوعا هي قابلة للهذا البروتوكول. وعلاوة على ذلك، ونحن نقدم إثبات صحة المبدأ البيانات باستخدام سرطان الثدي خط الخلية BT474، مؤكدا علىالاعتماد على التضخيم من عامل نمو البشرة مستقبلات HER2 وتحور فوسفتيدلينوستول-4،5-biphosphate 3-كيناز (PIK3CA) عندما نمت كما الكروية الورم. وأخيرا، ونحن قادرون على مواصلة التحقيق والتأكد من تأثير المكاني لهذه التبعيات باستخدام المناعية.
Introduction
الأورام الصلبة عرض النسيجية كبيرة، وراثي والجزئي البيئي التجانس داخل الورم، الذي يعرض الأطباء مع تحديا كبيرا في القدرة على علاج المرضى بنجاح. غالبية النماذج المستخدمة لتحديد رواية استهدفت العلاجات لا تتضمن الكثير من هذه الميزات. في الواقع، لقد تم تطوير العلاجات المستهدفة الحالية المستخدمة في عيادة في العقد الماضي باستخدام نهج الفرز التي تعتمد على خطوط الخلايا السرطانية المزروعة في ظل ظروف ثنائي الأبعاد (2D) الثقافة. على الرغم من أن هذا أدى إلى نجاحات مختلفة، مثل مثبطات مستقبلات التيروزين كيناز، أصبح من الواضح أن المزيد من النماذج المعقدة من السرطان المطلوبة لنقدر تماما العوامل المساهمة التي تدفع تكون الأورام في الجسم الحي، وزيادة عدد من العلاجات الجديدة التي تجعل الانتقال من نماذج ما قبل السريرية إلى التجارب السريرية. وعلاوة على ذلك، فإنه الآن بتقدير جيد أن أنظمة ثقافة 2D تفشل لتعكس فيفيفو سلوك 1،2. على سبيل المثال، في أورام أوعية دموية سيئة، حيث أن الطلب على الأوكسجين والمواد المغذية داخل المكروية يفوق العرض، ومناطق من الولادات العالية والمنخفضة تتطور. وجود الأكسجين المنخفض (نقص الأكسجين) في الأورام، والكشف عنها من قبل تلطيخ المناعى من المقاطع الورم لعلامات نقص الأوكسجين إنشاء مثل الأنهيدراز الكربونيك التاسع (CAIX)، يرتبط مع نتائج السريرية الأكثر فقرا في سرطان الثدي 3،4 ميزات وهكذا دمج مثل نقص الأكسجين في نماذج الفحص قد يؤدي إلى تعزيز قدرتنا على اكتشاف أهداف المخدرات الرواية التي سوف تكون أكثر فعالية في الجسم الحي. في الواقع، تمكنت بنجاح من استهداف الأورام العدوانية التي تحتوي على نقص الأكسجين هو الأولوية السريرية 5.
ويغير التقليدية فحص 2D سيرنا، في محاولة لتلخيص أكثر دقة عناصر من الشروط التي الخلايا السرطانية التي واجهتها في المكروية الورم، وأدى إلى تحديد عدة جينات عشرفي وقد وجد أن تكون مهمة لنمو الورم في الجسم الحي. وتشمل هذه الشاشات الجينومية الوظيفية التي تجرى في ظروف المصل منخفضة 6، 7 ظروف نقص الأوكسجين وفي تركيبة 8. على سبيل المثال، إسكات 6 فوسفو-2-كيناز / الفركتوز-2،6-Biphosphatase 4 (PFKFB4)، وهو بروتين مسؤول عن تنظيم الكربون تحلل الدخول، يتسبب فقط في موت الخلايا المبرمج خطوط سرطان البروستاتا المستمدة من ورم خبيث عندما نمت في مصل الدم المنخفض. كان إسكات PFKFB4 في خطوط خلايا البروستاتا الطبيعية في ظل نفس الظروف أي تأثير، في حين، ونضوب PFKFB4 ذاب تماما نمو البروستاتا خط الخلايا السرطانية xenografts 6.
في لوحة طويلة من خطوط خلايا سرطان الثدي، وإسكات أحادية كربوكسيلاز نقل 4 (MCT4) أدى بشكل تفضيلي في الحد من نمو خط الخلية تحت ظروف نقص الأوكسجين. تم التحقق من صحة هذا الضعف في الجسم الحي في سرطان الثدي خط الخلية xenogra المتعامدةFTS. وكان ربما أكثر لافت للنظر، إسكات أسيتيل التميم مخلقة 2 (ACSS2)، وهو الانزيم المسؤول عن تحويل خلات إلى أسيتيل التميم، وانخفاض عدد الخلايا السرطانية تحت ظروف الإجهاد المغذيات (انخفاض الأكسجين والدم) ولكن القليل أو أي تأثير في ظل ظروف ثقافة العادية 8. أثرت الاجتثاث من ACSS2 نمو الثدي وسرطان البروستاتا xenografts مما يشير إلى أن التدرجات الغذائية لا وجود لها في عزلة داخل المكروية الورم وأن الخلايا الموجودة في هذه المناطق ضرورية لتطور الورم 8. وعلاوة على ذلك، تم العثور على ACSS2 أيضا أن من المهم في الإصابة بالورم الأرومي الدبقي وسرطان الخلايا الكبدية 9،10، مما يعني أن زيادة النشاط ACSS2 في الأورام يمكن أن تكون آلية الأساسية التي تدعم النمو في ظل ظروف غير مواتية.
بشكل جماعي، هذه الدراسات تثبت أن تلخص الظروف التي واجهتها في الجسم الحي وأداء شاشات سيرنا يسمح لتحديد زأنيس الأساسية للبقاء على قيد الحياة سرطان. وكذلك تؤثر على نمو الخلايا السرطانية 2D تحت ظروف الإجهاد المغذيات، تحول دون استنزاف الجينات المستهدفة في هذه الدراسات السرطان نمو كروي خط الخلية، وهو ما يعكس ما لوحظ في xenografts الورم 6،8. وهكذا، الكروية خط الخلايا السرطانية تحتوي على العديد من الشروط التي واجهتها في المكروية الورم الذي نقل حساسية لإسكات ACSS2. في الواقع، الكروية عرض التدرجات المواد الغذائية (المصل والأوكسجين)، والتغيرات في درجة الحموضة، وثلاثي الأبعاد (3D) خلية خلية الاتصال، ولكن أيضا، وتعديلات في سرعته التكاثري مع الخلايا التي تمر اعتقال دورة الخلية وموت الخلايا المبرمج. ويتمثل ذلك من خلال وجود في الكروية سرطان المناطق الميتة، وهي ميزة لا توجد في ثقافة 2D التقليدية.
وقد تم بالفعل استخدام الكروية الخلايا السرطانية كما النماذج ذات الصلة أكثر بيولوجيا لفحص مثبطات جزيء صغير ولكن هذا يسمح فقط للتحقق من صحة فعالية مركب أو تطويعها لأغراض أخرى من كومبوجهاز الأمم المتحدة الإنمائي تصميم أصلا لأمراض أخرى (11). طرق كروي الفحص الحالية لا تسمح لتحليل نضوب جين معين في الإنتاجية العالية من الطريقة عالية المحتوى. هنا، نحن تصف لأول مرة، خط أنابيب علم الجينوم وظيفية لكشف تبعيات جينية معينة باستخدام تكنولوجيا الصغيرة بالتدخل RNA (سيرنا) في سرطان الكروية خط الخلية. لقد قمنا بتصميم مكتبة مفصل مع الرناوات siRNAs استهداف 200 من الجين المتحول في أغلب الأحيان في سرطانات الثدي البشرية وتقييم تأثير استنفاد الجينات على حجم كروي والنشاط الأيضي في BT474 الكروية سرطان الثدي. كنا قادرين على بقوة وبتكاثر كشف عن تأثير ERBB2 وPIK3CA إسكات في الثقافات 3D. وعلاوة على ذلك، فإننا لا يمكن تقييم أثر نضوب الجينات على بنية المكانية الكروية BT474 باستخدام المناعية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يجري استخدام نماذج ثلاثية الأبعاد للسرطان على نحو متزايد لتقييم فعالية من المركبات المعروفة والجديدة التي تم تصميمها لقتل انتقائي الخلايا السرطانية. الكروية الخلايا السرطانية هي هياكل التي تعرض ظروف أكثر مماثلة لتلك التي واجهتها في الأورام في الجسم الحي، وبالتالي المركبات التي زادت فعالية في 3D هم أكثر عرضة ليكون لها تأثير في الجسم الحي. ومع ذلك، هذه الطرائق لا تسمح لتحديد أهداف محتملة الرواية التي لم تكن موضوع تصميم الأدوية التي يمكن أن يكون لها فعالية كبيرة في علاج السرطان.
قمنا بتطوير سيرنا علم الجينوم الوظيفي النهج الذي سمح لإسكات الجينات دائم لمدة تصل إلى سبعة أيام في سرطان الكروية خط الخلية. هناك العديد من الخطوات الهامة للبروتوكول التي تتطلب التحسين قبل لا يمكن أن يؤديها شاشة سيرنا. القدرة على تكوين الأجسام الشبه الكروية قابلة للحياة استنساخه على نطاق واسع أمر ضروري. علاوة على ذلك،شروط ترنسفكأيشن ppropriate ينبغي أن يكون الأمثل بدقة. نقترح عليك تجريب عدة الكواشف ترنسفكأيشن مختلفة مع عدم استهداف المناسب وقتل الضوابط قبل محاولة الشاشة. كنا قادرين على إظهار أن العديد من يشيع استخدامها خطوط خلايا سرطان الثدي، وهي BT474، كانت MCF10DCIS.com، MDA-MB-231 وJIMT1 قابلة للسيرنا ترنسفكأيشن. وعلاوة على ذلك، ونحن نقدم إثبات صحة المبدأ البيانات فحص 200 من الجين المتحول في أغلب الأحيان في سرطان الثدي في الكروية BT474، أكدت اعتمادها على التضخيم من HER2 وطفرة أنكجنيك من PIK3CA. ومن المثير للاهتمام، أدى إسكات FOXO3 عامل النسخ إلى انخفاض في حجم كروي ولكن ليس له تأثير كبير على قدرتها على البقاء. ومن المعروف FOXO3 لتنظيم استجابة لنقص الأكسجين، وتغيير القدرة على التمثيل الغذائي للخلايا السرطانية مما يسمح لهم للتكيف بسهولة أكبر مع بيئتها 16. هذا الدور الذي يمكن أن يحتمل تتداخل مع القراءة بقاء الخلية كما يكشف ATP وفرة، واحدة من المنتجات الرئيسية للاستقلاب الخلية.
ودعما للمراقبة انخفاض في حجم كروي، فقد تبين أن إسكات FOXO3 في هيلا xenografts ضعف نمو الورم ويتسبب موت الخلايا المبرمج 17. من المهم أن نلاحظ أن بعض الجينات قد تؤثر على قدرة الخلايا السرطانية على الاحتفاظ الهندسة المعمارية 3D، والتي يمكن أن تؤدي إلى ايجابيات كاذبة. على سبيل المثال، أدت ضربة قاضية من E-كادهيرين في حل BT474 هيكل كروي. تم الإبلاغ عن هذا مسبقا باستخدام E-كادهيرين المستهدفة الأجسام المضادة 18. كما هو الحال مع أي منصة الفرز، يجب rescreened الأهداف المحتملة لتقييم استنساخ تأثير ملاحظتها. هناك قيود على هذه التقنية، وهي طبيعة عابرة للضربة قاضية الجينات بوساطة سيرنا. كانت متواصلة إسكات أكثر من سبعة أيام لا يمكن تحقيقها مع سيرنا.
وميزة هذا النهج هو أنه يمكن أن يقترن مع مختلف إحيائية أخرىالأصباغ TRIC ليس فقط تلك التي تقيم الجدوى كروي، على سبيل المثال، وإعطاء المعلومات المكانية من نقص الأكسجة كروي أو مراقبة الخلايا التي تمر موت الخلايا المبرمج. وعلاوة على ذلك، لأن بمسح لوحة القارئ سريعة نسبيا وغير الغازية، وتأثير الرناوات siRNAs على حجم كروي يمكن تقييم مرور الوقت بدلا من مجرد عند نقطة نهاية التجريبية. في الواقع، ونحن حاليا بصدد استكشاف العديد من هذه السبل في خط أنابيب الفحص والتدقيق. نهجا بديلا التي تستخدم الثقافات 3D لتحديد تبعيات جديدة هو استخدام المكتبات الكيميائية التي تمنع أي مجموعة واسعة من الأهداف أو أسر معينة من البروتينات. في الواقع، Bitler وآخرون. تستخدم هذه الطريقة تستهدف التعرف على التفاعل الفتك الاصطناعية بين الحالة ARID1A ومثبطات EZH2 في المبيض سرطان الخلايا واضحة (19). وقد سمح اكتشاف كريسبر-Cas9 تكنولوجيا التحرير الجين أيضا لتطوير شاشات الوراثية في الثقافات عضي وفي الجسم الحي. ومع ذلك، رمنهجه يعتمد على وجود مرافق الحيوانات المناسبة ويمكن أن تكلف باهظة 20.
في الختام، ونحن نعتقد أننا قمنا بتحديد البروتوكول الذي أكثر دقة النماذج الأكسجين والمغذيات التدرجات، التي هي من سمات المكروية الورم في الجسم الحي، والسماح لتحديد أهداف سرطان جديدة أو التحقق من صحة قوية من الأهداف المحددة. وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق بروتوكول لدينا أي نوع من خط الخلية التي تشكل الكروية، وبالتالي يمكن استخدامها بشكل روتيني في المجتمع أبحاث السرطان للشاشات سيرنا الإنتاجية العالية.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Fredrik Walberg (FACS and imaging facility, ICR) for assistance with microscopy. This work was funded by Breast Cancer Now. RN is the recipient of a Breast Cancer Now Career Development Fellowship (2011MaySF01).
Materials
| Lullaby | Oz Biosciences | LL70500 | lipid-based transfection reagent |
| Viromer | Lipocalyx | VB-01LB-01 | virus-like polymer transfection reagent |
| Ultra-low attachment plate | Corning | CLS7007 | 96 well plate |
| Foil plate seals | ThermoFisher | AB-0626 | |
| Luminescent cell viability dye | Promega | G7570 | CellTitre-Glo |
| Pipette tips (200ul) | Starlab | S1111-0806 | |
| Pipette tips (10ul) | Starlab | S1111-3800 | |
| Pipette tips (1000ul) | Starlab | S1122-1830 | |
| Serological pipettes (5ml) | Sarstedt | 86.1253.025 | |
| Serological pipettes (10ml) | Sarstedt | 86.1254.025 | |
| Serological pipettes (25ml) | Sarstedt | 86.1685.020 | |
| RPMI Media | GIBCO | 11875-093 | |
| DMEM Media | GIBCO | 11965-084 | |
| Opti-MEM | GIBCO | 31985070 | |
| Feta bovine serum | GIBCO | 16140063 | |
| siRNA | Dharmacon | Cherry picked library | |
| Countess Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10312 | |
| Celigo S | Nexcelom | contact company | |
| Victor X5 | Perkin Elmer | contact company | |
| Benchtop centrifuge | Various | ||
| Axiovert Inverted brightfield microscope | Zeiss | contact company | |
| Tissue culture C02 Incubator | Various | ||
| Mulitichannel pipette | Various |
Referenzen
- Seton-Rogers, S. E., et al. Cooperation of the ErbB2 receptor and transforming growth factor beta in induction of migration and invasion in mammary epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (5), 1257-1262 (2004).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Chia, S. K., et al. Prognostic significance of a novel hypoxia-regulated marker, carbonic anhydrase IX, in invasive breast carcinoma. J Clin Oncol. 19 (16), 3660-3668 (2001).
- Trastour, C., et al. HIF-1alpha and CA IX staining in invasive breast carcinomas: prognosis and treatment outcome. Int J Cancer. 120 (7), 1451-1458 (2007).
- Wilson, W. R., Hay, M. P. Targeting hypoxia in cancer therapy. Nat Rev Cancer. 11 (6), 393-410 (2011).
- Ros, S., et al. Functional metabolic screen identifies 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 4 as an important regulator of prostate cancer cell survival. Cancer Discov. 2 (4), 328-343 (2012).
- Baenke, F., et al. Functional screening identifies MCT4 as a key regulator of breast cancer cell metabolism and survival. J Pathol. 237 (2), 152-165 (2015).
- Schug, Z. T., et al. Acetyl-CoA synthetase 2 promotes acetate utilization and maintains cancer cell growth under metabolic stress. Cancer Cell. 27 (1), 57-71 (2015).
- Mashimo, T., et al. Acetate is a bioenergetic substrate for human glioblastoma and brain metastases. Cell. 159 (7), 1603-1614 (2014).
- Comerford, S. A., et al. Acetate dependence of tumors. Cell. 159 (7), 1591-1602 (2014).
- Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. J Vis Exp. (99), e52686 (2015).
- Vinci, M., Box, C., Zimmermann, M., Eccles, S. A. Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents. Methods Mol Biol. 986, 253-266 (2013).
- Barretina, J., et al. The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity. Nature. 483 (7391), 603-607 (2012).
- Maguire, S. L., et al. SF3B1 mutations constitute a novel therapeutic target in breast cancer. J Pathol. 235 (4), 571-580 (2015).
- Brough, R., et al. Functional viability profiles of breast cancer. Cancer Discov. 1 (3), 260-273 (2011).
- Ferber, E. C., et al. FOXO3a regulates reactive oxygen metabolism by inhibiting mitochondrial gene expression. Cell Death Differ. 19 (6), 968-979 (2012).
- Jensen, K. S., et al. FoxO3A promotes metabolic adaptation to hypoxia by antagonizing Myc function. EMBO J. 30 (22), 4554-4570 (2011).
- Ivascu, A., Kubbies, M. Diversity of cell-mediated adhesions in breast cancer spheroids. Int J Oncol. 31 (6), 1403-1413 (2007).
- Bitler, B. G., et al. Synthetic lethality by targeting EZH2 methyltransferase activity in ARID1A-mutated cancers. Nat Med. 21 (3), 231-238 (2015).
- Dow, L. E., et al. Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. Nat Biotechnol. 33 (4), 390-394 (2015).
