Summary

Mikroglia als Surrogate Biosensor Nanoparticle Neurotoxicity zu ermitteln

Published: October 25, 2016
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Summary

Microglia (immune cells of the brain), are used as a surrogate biosensor to determine how nanoparticles influence neurotoxicity. We describe a series of experiments designed to assay microglial response to nanoparticles and exposure of hypothalamic neurons to supernatant from activated microglia to determine neurotoxicity.

Abstract

Nanoparticles found in air pollutants can alter neurotransmitter profiles, increase neuroinflammation, and alter brain function. Therefore, the assay described here will aid in elucidating the role of microglia in neuroinflammation and neurodegenerative diseases. The use of microglia, resident immune cells of the brain, as a surrogate biosensor provides novel insight into how inflammatory responses mediate neuronal insults. Here, we utilize an immortalized murine microglial cell line, designated BV2, and describe a method for nanoparticle exposure using silver nanoparticles (AgNPs) as a standard. We describe how to expose microglia to nanoparticles, how to remove nanoparticles from supernatant, and how to use supernatant from activated microglia to determine toxicity, using hypothalamic cell survival as a measure. Following AgNP exposure, BV2 microglial activation was validated using a tumor necrosis factor alpha (TNF-α) enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The supernatant was filtered to remove the AgNP and to allow cytokines and other secreted factors to remain in the conditioned media. Hypothalamic cells were then exposed to supernatant from AgNP activated microglia and survival of neurons was determined using a resazurin-based fluorescent assay. This technique is useful for utilizing microglia as a surrogate biomarker of neuroinflammation and determining the effect of neuroinflammation on other cell types.

Introduction

Umweltbelastungen, insbesondere diejenigen der Nanopartikel (NP) Bereich (1 – 20 nm Durchmesser), haben aufgrund der Fähigkeit zur Fettleibigkeit und anderen neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht worden 1-3 die Blut – Hirn – Schranke zu überwinden. Erhöhte Exposition gegenüber Verschmutzung kann eine Entzündung im zentralen Nervensystem, den Hypothalamus 1 induzieren. Ein potentieller Mechanismus , bei dem dies geschieht , durch Nanopartikel induzierte Aktivierung von Mikroglia (brain Immunzellen) 4 sein könnte. Frühere Studien haben invivo – Modellen verwendet , um die Auswirkungen von Nanopartikeln auf die Gesundheit des Gehirns zu untersuchen , die zeitaufwendig, teuer, und antworten Sie nicht direkt auf die Frage, wie NPs Mikroglia beeinflussen. Mikroglia spielen eine facettenreiche Rolle im zentralen Nervensystem, einschließlich der Wartung des Gehirns Mikroumgebung und die Kommunikation mit Neuronen über die Freisetzung von sekretierten Faktoren und Zytokine umgibt. In Abhängigkeit von den Stimuli können Mikroglia zu einem M1 pr aktivierbaro-entzündliche oder M2 anti-inflammatorische Zustand. Beispielsweise Aktiv M1 lösen Mikroglia proinflammatorische Zytokine wie Tumor-Nekrose-Faktor alpha (TNF-α), während M2 Mikroglia Freisetzung anti-inflammatorische Zytokine einschließlich Interleukin-4 (IL-4) aktiviert. Um unsere Leihmutter invitro – Biosensor zur Bestimmung von Neurotoxizität von Luftschadstoffen zu validieren, wir gemessen Mikroglia Reaktion auf 20 nm Silber – Nanopartikel (AGNPS). Das Ziel dieses Artikels ist es zu beschreiben , wie ein invitro – Mikroglia – Zelllinie kann zum Testen murine Mikroglia Reaktion auf NPs und wie Mikrogliaaktivierung wirkt Hypothalamus Zellen als Ersatz Biosensor Marker verwendet werden. Die langfristige beabsichtigte Anwendung dieser validierten Modelleffekte aus der realen Welt Schadstoffen auf die Gesundheit des Gehirns und neurodegenerative Krankheit zu prüfen ist. Wir stellen eine detaillierte Beschreibung eines in vitro 96-Well – Format – Assay für die im Anschluss an die Belichtung von mic Mikroglia – Aktivierung und hypothalamischen Zellüberlebensmess roglial konditionierten Medien.

Mikrogliaaktivierung wurde nach AgNP Exposition bestimmt einen TNF-α Enzym Linked Immuno Assay (ELISA). Um die Wirkung von aktivierter Mikroglia auf Hypothalamus-Zellen zu bestimmen, wurden die AGNPS von Mikroglia-Überstand (konditioniertes Medium) unter Verwendung einer Filtrationsvorrichtung entfernt. Die Filtervorrichtung behält während Zytokine die AGNPS ohne basierend auf Größe. Kurz gesagt, Überstand aus mit oder ohne AGNPS behandelt Mikroglia wurde zu den Filtern gesammelt, zugegeben und bei 14000 × g für 15 min zentrifugiert. Wir waren dann in der Lage, den Einfluss von Mikroglia-Zytokine auf Hypothalamus die Lebensfähigkeit der Zellen zu bestimmen. Zelltoxizität zu konditionierten Medien (enthaltend Zytokine) nach der Belichtung wurde mittels eines Resazurin-basierten Assay bestimmt , wie zuvor beschrieben , 5,6. Metabolisch aktive Zellen reduzieren Resazurin und ein Fluoreszenzsignal proportional zur Anzahl der lebensfähigen Zellen 7 herzustellen.

nt "> Es gibt mehrere Vorteile dieses Verfahrens gegenüber anderen (zB Co-Kultur, trans-well – Setups oder in vivo – Experimente). Unser Modell die Fähigkeit Mikroglia direkt aktivieren liefert und festzustellen , ob sekretierten Faktoren Neuronen 8 toxisch sind . der aktuelle Protokoll verwendet immortalisierten BV2 Mikroglia mit 20 nm Durchmesser Nanopartikel stimuliert und immortalisierten murinen Hypothalamuszellen (mHypo-A1 / 2 bezeichnet) 9 zur Bestimmung der anschließenden Reaktion. Während dieses Protokoll für diese besonderen Bedingungen optimiert worden ist, können die Verfahren sein , verändert in anderen Modellen der Mikroglia-induzierten Zelltod verwendet werden, oder mit anderen Zelltypen, einschließlich primärer Mikroglia und Neuronen.

Protocol

1. Mikroglia Zellkultur Wartung Warm Zellkulturmedium (Dulbecco Modified Eagle Medium; DMEM), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin / Neomycin (PSN) bis 37 ° C. Erhalten Sie gefrorene Lager von BV2 Mikroglia-Zellen bei Passage 18 – 25 von Lagerung bei -80 ° C. Schnell auftauen Zellen in 37 ° C warmen Wasserbad. Sanft Zellen auf eine 75 cm 2 innen belüfteten Kolben übertragen Kulturmedien , die 10 ml – Zelle. Inkubieren Kolben…

Representative Results

Wir zeigen, dass Mikroglia Funktion als Surrogat Biosensor für Gehirn Reaktion auf Nanopartikel das Protokoll oben. Die Ergebnisse umfassen die Messung der toxischen Wirkungen von Mikroglia – Aktivierung auf nachgeschaltete neuronalem Zelltod. 1 ein Arbeitsablauf des Protokolls Mikroglia zu aktivieren und zu bestimmen , ob sekretierten Zytokine reduzieren Lebensfähigkeit von hypothalamischen Neuronen demonstriert. TNF-α – Sekretion wurde nach AgNP Exposition (…

Discussion

Recent studies support that environmental exposure contributes to obesity and other neurodegenerative diseases 11,12. However, techniques used in previous studies are time consuming and expensive. Economic considerations, physiologically relevant delivery systems, ethical issues with extensive use of in vivo animal models, and difficulty translating findings into meaningful health advisories are a few of the major challenges that have impeded advancements in studying NP-induced neurotoxicity 13</…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was funded by the US Department of Veterans Affairs BLR&D IK2 BX001686 (to TAB), and grants from the University of Minnesota Healthy Foods, Healthy Lives Institute (to CMD, JPN, and TAB) and the Minnesota Veterans Medical Research & Education Foundation (to TAB). We thank Drs. Philippe Marambaud (Feinstein Institute for Medical Research, Manhasset, NY) and Weihua Zhao (Methodist Hospital, Houston, TX) for providing the BV2 cell line.

Materials

Cells/Reagents
Mouse microglial cell line (BV2) Interlab Cell Line Collection (Genoa, Italy) ATL03001
Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2  Cellutions Biosystems Inc. CLU172
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium Invitrogen 10313-039
Fetal bovine serum  PAA Labs A15-751
Penicillin/Streptomycin/Neomycin Thermo Fisher Scientific 15640-055
Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 25200056
Silver nanoparticles (20nm) Sigma-Aldrich 730793

PrestoBlue Cell Viability Reagent
Invitrogen A13262
Mouse TNF-α ELISA Max Delux Biolegend 430904
Lipopolysaccharide Sigma-Aldrich L4391
Sodium Citrate Sigma-Aldrich S4641
Equipment
96W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile Thermo Fisher Scientific 165305
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane EMD Millipore UFC501008
SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate Molecular Devices M5
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes Corning, Inc
14-432-22
Falcon Cell Strainers 70 μm Corning, Inc 08-771-2
Tabletop centrifuge 5430 Eppendorf 22620560

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Duffy, C. M., Ahmed, S., Yuan, C., Mavanji, V., Nixon, J. P., Butterick, T. Microglia as a Surrogate Biosensor to Determine Nanoparticle Neurotoxicity. J. Vis. Exp. (116), e54662, doi:10.3791/54662 (2016).

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