Un test fluorescenza a base di fosfolipidi Scramblase Activity

La rodopsina fotorecettore, un G protein-coupled receptor prototipo (recensito ad esempio in riferimento ^1), è il primo scramblasi essere identificati e biochimicamente verificato ^2,3. Scramblases sono trasportatori fosfolipidi che aumentano il tasso intrinsecamente lento movimento transbilayer fosfolipide a fisiologicamente livelli appropriati in un bidirezionale, modalità ATP-indipendenti ^4-6. Esempi di loro azioni possono essere trovati nel reticolo endoplasmatico e batterica membrana citoplasmatica dove è necessaria scrambling costitutivo per l'omeostasi di membrana e la crescita, così come per una varietà di percorsi di glicosilazione ^5. Scrambling fosfolipide regolamentata è necessaria per esporre fosfatidilserina (PS) sulla superficie delle cellule apoptotiche dove agisce come un "mangia-me" -signal per macrofagi ⁷ e fornisce una superficie procoagulante sulle piastrine attivate per catalizzare la produzione di fattore proteicos necessaria per la coagulazione del sangue. In membrane disco fotorecettori, l'attività scrambling di rodopsina è stato suggerito di contrastare lo squilibrio fosfolipidi tra i due volantini membrana del doppio strato che viene generato dalla ATP-dipendente, lipidi unidirezionale flippase ABCA4 ^{4,8,9 10-12.}

Nonostante l'importanza fisiologica di scramblases, la loro identità è rimasta inafferrabile fino rodopsina è stato segnalato come un scramblase nei dischi dei fotorecettori ^2, i membri della famiglia di proteine ​​TMEM16 sono stati identificati come Ca ²⁺ scramblases -dipendenti necessari per l'esposizione di PS a livello della membrana plasmatica (recensione in riferimento ^13), e la proteina batterica FTSW stato proposto come scramblase richiesto un lipide II per la sintesi del peptidoglicano ^14. Queste scoperte sono state basate sulla ricostituzione delle proteine ​​purificate in liposomi e dimostrazione di attività scramblase nelle proteoliposomi risultanti mediante la metodologia describcato qui. Altri potenziali scramblases ^15-21 – Le proteine ​​MurJ e AMJ implicati nella biosintesi peptidoglicano, WzxE e proteine ​​correlate implicati in rimescolando precursori O-antigene, le proteine ​​MPRF bisogno di traslocare phosphatidylglycerol aminoacylated attraverso la membrana citoplasmatica batterica, e membri della famiglia Xkr8 che sono stati proposti esporre PS sulla superficie delle cellule apoptotiche – restano da testare biochimicamente. Questo mette in evidenza l'importanza di un saggio robusto per identificare e caratterizzare l'attività scramblase.

Qui, descriviamo la ricostituzione di opsin purificata, la apoprotein della rodopsina fotorecettore, in grandi vescicole unilamellari (luvs), e la successiva analisi dell'attività scramblase nelle proteoliposomi risultante utilizzando un saggio basato sulla fluorescenza. Ci sono diversi protocolli ben descritto in letteratura per l'espressione eterologa e purificazione di opsin, quindi non ci saràdescriverlo in questo protocollo; usiamo i protocolli descritti nelle Goren et al. ^3, che i rendimenti FLAG-tag, opsina termostabile a circa 100 ng / ml a 0,1% (w / v) dodecylmaltoside (DDM).

Ricostituzione si ottiene trattando luvs con detersivo sufficiente in modo che si gonfiano, ma non si sciolgono. In queste condizioni, una proteina di membrana – fornita in forma di micelle proteina-detergente – integrerà nei liposomi e diventare ricostituito nella membrana del liposoma alla rimozione del detersivo, causando proteoliposomi. Per ricostituire opsin (ottenuto come proteina purificata nello 0,1% (w / v) DDM), luvs sono preparati da una miscela di POPC (1-palmitoil-2-oleoyl- sn -glycero-3-phosphocholine) e POPG (1- palmitoil-2-oleoyl- SN -glycero-3- [fosfo-rac- (1-glicerolo)]) e satura di DDM prima di aggiungere opsina e NBD-PC. Il detergente viene poi rimosso mediante trattamento del campione con perle di polistirene.

<p c lass = "jove_content"> Il principio alla base del saggio basato sulla fluorescenza è mostrato nella Figura 1B. Luvs sono simmetricamente ricostituiti con una quantità traccia di NBD-PC o un altro giornalista di fosfolipidi fluorescente NBD marcato (Figura 1A). In aggiunta ditionito, un non fluorescente dianione membrana impermeant, molecole NBD-PC nel foglietto esterno delle luvs sono resi come nitro-gruppo di NBD è ridotta ad un ammino-gruppo non fluorescente. Poiché né molecole NBD-PC né ditionito sono in grado di attraversare la membrana sulla scala temporale dell'esperimento (<10 min), questo si traduce in una riduzione del 50% del segnale fluorescente. Tuttavia, se i liposomi sono ricostituiti con una scramblase, molecole NBD-PC nel foglietto interno possono rimescolare rapidamente all'esterno dove vengono ridotti. Ciò comporta la perdita totale della fluorescenza nel caso ideale (Figura 1C).

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. Figura 1: Rappresentazione schematica del saggio di attività scramblase Il saggio utilizza una fluorescenza NBD marcato reporter di lipidi; NBD-PC è mostrato (A). Le grandi vescicole unilamellari sono ricostituiti con una quantità traccia di NBD-PC. Ricostituzione produce vescicole simmetriche, con NBD-PC distribuito equamente negli opuscoli esterne ed interne. Ditionito (S ₂ O ₄ ^2-) riduce chimicamente il nitro-gruppo di NBD ad un ammino-gruppo non fluorescente. Trattamento di liposomi privi di proteine ​​con ditionito (B, top) causa una riduzione del 50% della fluorescenza poiché solo le molecole NBD-PC nel foglietto esterno vengono ridotti: ditionito è caricato negativamente e non possono attraversare la membrana per reagire con molecole NBD-PC nel foglietto interno. Trattamento dithionite di proteoliposomi opsin contenenti (B, in basso), vale a dire, proteoliposomi scramblase-attiva, si traduce in perdita di 100% di fluorescence come opsina facilita il movimento di NBD-PC tra l'interno e il foglietto esterno. (C) mostra le tracce di fluorescenza idealizzate ottenuti sul trattamento liposomi senza proteine ​​e proteoliposomi opsin contenenti con ditionito. Il tasso di perdita di fluorescenza è la stessa in entrambi i casi che indicano che la riduzione chimica dei NBD da ditionito è limitante, e che scrambling avviene ad una velocità uguale o superiore alla velocità della reazione chimica. Tracce ottenuti da un esperimento reale sono mostrati in figura 3. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

I metodi che descriviamo possono essere utilizzati per ricostituire e saggiare altre proteine ​​purificate, nonché miscele di proteine ​​di membrana ottenute, ad esempio, estraendo microsomi con detergente ^22.