Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.
Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not naïve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.
Гематоэнцефалический барьер отделяет системный кровоток от центральной нервной системы (ЦНС) , 1 – 3. Она обеспечивает физический барьер, который препятствует свободному движению клеток и диффузии водорастворимых молекул и защищает мозг от патогенов и потенциально опасных веществ. В дополнение к барьерной функции, ГЭБ обеспечивает доставку кислорода и питательных веществ к паренхиме головного мозга, что обеспечивает надлежащее функционирование нервной ткани. Функциональные свойства ГЭБ высоко регулируются его клеточных и межклеточных компонентов, с узкоспециализированными КЭ является ее основным структурным элементом. КЭ ГЭБ характеризуются наличием плотного контакта (TJ) комплексов, отсутствие фенестраций, крайне низкой пиноцитозные активностью и постоянно активных транспортных механизмов. Другие компоненты ВВВ базальная мембрана EC, перицитов вложения эндотелий, астроцитов концевые ноги и = ассоциированных парenchymal базальная мембрана также внести свой вклад в развитие, поддержание и функции ВВВ 2,4 – 6 и, вместе с нейронами и микроглии, образуют сосудисто – нервный узел (НВУ), что позволяет надлежащее функционирование ЦНС 7 – 9.
В различных неврологических заболеваний, таких как нейродегенеративные, воспалительные или инфекционные заболевания, функция ГЭБ скомпрометирован 2,5,10. Дисрегуляция TJ комплексов и механизмов молекулярных транспорта приводит к повышению проницаемости ГЭБ, лейкоцитов, воспаление и повреждение нейронов. Для изучения свойств ГЭБ при таких патофизиологических условиях, различные модели в пробирке ВВВ были установлены 9,11,12. Вместе они предоставили ценную информацию о изменениях целостности барьера, проницаемости, а также транспортных механизмов. Эти модели используют эндотелиальные клетки человека, мыши, крысы, свиньи или бовечьего происхождения 13 – 18; Первичные эндотелиальные клетки или клеточные линии культивируют либо в виде монокультуры или вместе с перицитов и / или астроцитов, чтобы более точно имитировать ГЭБ в естественных условиях 19 – 25. В последние годы, измерение трансэндотелиальном электрического сопротивления (Тир) стала широко распространенным инструментом для оценки эндотелиальной барьерных свойств 26,27.
TEER отражает полное сопротивление ионного потока через клеточный монослой и его снижение обеспечивает чувствительное измерение целостности эндотелиальной скомпрометированы барьера и, следовательно, повышенной проницаемости. Различные системы измерения Teer были разработаны, в том числе эпителиальной Voltohmmeter (EVOM), электрический Cell-подложка импеданса зондированию (ВЕ) и клеточного анализа в реальном масштабе времени 15,28 – 30. TEER отражает сопротивление потока ионов между соседними КЭ (парацеллюлярная маршрута) и прямо пропорциональнацелостности барьера. В импедансной спектроскопии 27,31, комплексное полное сопротивление (Z) измеряется, которая обеспечивает дополнительную информацию о целостности барьера путем измерения CCL. Ccl относится к емкостной ток через клеточную мембрану (трансцеллюлярного маршрут): Клеточный слой действует как конденсатор в эквивалентной электрической цепи, разделяющей заряды на обеих сторонах мембраны и обратно пропорционален целостности барьера. При выращивании на проницаемые вставок, КЭ прилипать, пролиферируют и распространяются на микропористой мембраны. Это противодействует фоновый емкостного тока вставки (который сам по себе действует как конденсатор) и приводит к уменьшению емкости до тех пор, пока не достигнет своего минимального уровня. За этим следует путем создания TJ комплексов, которые перекрывают пространство между соседними КЧС. Это ограничивает поток ионов через маршрут парацеллюлярной и ТЭЭУ увеличивается, пока не достигнет своего плато. При воспалительных процессах, однако, endotheliаль барьер скомпрометирована: TEER уменьшается по мере TJ комплексы получают нарушается и Ccl возрастает по мере емкостной составляющей вставки снова поднимается.
Наше измерение TEER использует автоматизированную систему мониторинга ячейки 32: он следует принципу импедансной спектроскопии и расширяет свои предыдущие приложения. Здесь мы опишем экстракорпорального ВВВ модели в том , что позволяет исследовать барьерных свойств, в том числе взаимодействие мозга эндотелий с иммунными клетками; в частности, активированных Т-клеток. Такие патофизиологических условиях наблюдаются при аутоиммунных заболеваниях центральной нервной системы , таких как рассеянный склероз и его модели для животных экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита 33 – 37. Здесь решающим шагом является трансмиграция энцефалитогенных, миелин-специфических Т-клеток через ВВВ. Это сопровождается их реактивации в периваскулярной пространстве и вступление в паренхиме головного мозга, где они принимают на работу других иммунных клеток и меняственной воспаления и последующего демиелинизация 1,35,38. Однако молекулярные механизмы взаимодействия таких Т-клеток и эндотелиальных клеток, основными составляющими ГЭБ, не до конца понятны. Наш протокол призван восполнить этот пробел и дать новое понимание последствий на эндотелиальных клетках (то есть, целостность барьера и проницаемости) при их непосредственном контакте и взаимодействии с комплексным активированными Т – клетками.
Протокол, описанный здесь, использует первичный мозга мыши микрососудистой эндотелиальных клеток, выращенных в виде монослоя на проницаемых вставках с микропористым мембранам. Эндотелиальные клетки культивировании совместно с CD4 + Т – клеток, которые могут быть предварительно активированными либо поликлонально или в моде антиген-специфической. Совместное культивирование MBMECs с предварительно активированные, но не наивным Т-клеток индуцирует снижение TEER и увеличение в БКК, которая обеспечивает количественную меру дисфункции и разрушения барьера MBMEC. техникаявляется неинвазивным: он использует встроенный вместо Chopstick электродов, которые предотвращают серьезное нарушение общественного порядка монослоя ЕС; он может быть использован для мониторинга барьерной функции без использования клеточных маркеров. Это делает непрерывные измерения в автоматическом режиме и позволяет провести независимую оценку двух параметров барьера (Тир и CCL) одновременно с течением времени. Этот метод также достаточно чувствителен, чтобы различать разные уровни активации Т-клеток и эффектов таких Т-клеток на КЧС.
Он может быть использован в широком диапазоне функциональных анализов: различные цитокины и / или хемокины замешанные в воспалительных процессах могут быть добавлены к совместной культуре MBMECs и Т-клеток; можно использовать блокирующие антитела против молекул клеточной адгезии либо на ЕС или стороне Т-клеток; и ингибиторы маркеров активации Т-клеток или их цитолитического свойств могут быть добавлены во время примирования Т-клеток или их совместном культивировании с КЧС. Анализ также полезен для Т-клеток переселенииАнализы, так как он может служить в качестве контроля качества целостности монослоя MBMEC перед добавлением Т-клеток. Все это делает этот метод универсальный и надежный инструмент для изучения ГЭБ в пробирке, с акцентом на эффекте активированных Т – клеток на целостность монослоя EC. Это имеет особое значение для понимания механизмов нарушения ГЭБ в патогенезе аутоиммунных заболеваний, таких как MS и его животной модели EAE, где самореактивными, энцефалитогенных Т-клетки проникает через ГЭБ и вызывать воспаление и повреждение нейронов.
Несколько шагов описанного протокола имеют важное значение для успешного эксперимента. В ходе первоначальной изоляции и культуры MBMEC, крайне важно, что работа выполняется в стерильных условиях в максимально возможной степени, чтобы предотвратить загрязнение культуры клеток грибковы…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарны Анника Engbers и Франк Курта за их отличную техническую поддержку и д-р Маркус Шефер (nanoAnalytics GmbH) за полезные обсуждения, касающиеся измерений Тир. Эта работа была поддержана Немецким Исследовательским (DFG), SFB1009 проект A03 к HW и LK, CRC TR128, проекты A08; Z1 и B01 для LK и HW и Межотраслевой Центр клинических исследований (медицинский факультет Мюнстере) Номер гранта kl2 / 2015/14 для LK.
cellZscope | nanoAnalytics GmbH | www.nanoanalytics.com | including: 24-well Cell Module, Controller, PC with cellZscope software v2.2.2 |
Ultracentrifuge | Thermo Scientific | www.thermoscientific.com | SORVALL RC 6+; rotor F21S-8x50y; for MBMEC isolation |
flow cytometer | Beckman Coulter | www.beckmancoulter.com | for analysis of T cell transmigration |
FlowJo7.6.5 software | Tree Star | www.flowjo.com | for analysis of T cell transmigration |
Oak Ridge centrifuge tubes, PC | Thermo Fisher Scientific | 3118-0050 | 50 ml; for MBMEC isolation |
Transwell membrane inserts – pore size 0.4 µm | Corning | 3470 | for TEER measurement as the main readout |
Transwell membrane inserts – pore size 3 µm | Corning | 3472 | for TEER measurement as the quality control prior to T-cell transmigration assay |
24-well cell culture plate | Greiner | 650 180 | flat-bottom; for MBMEC culture |
96-well cell culture plate | Costar | 3526 | round-bottom; for immune cell culture |
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | for T cell and B cell isolation; supports MACS LS columns |
OctoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | for dendritic cell isolation; supports MACS MS columns |
Neubauer counting chamber | Marienfeld | MF-0640010 | for cell counting |
Cell strainer, 70 µm | Corning | 352350 | for immune cell isolation |
Cell strainer, 40 µm | Corning | 352340 | for immune cell isolation |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | for immune cell isolation |
MACS LS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | for T cell and B cell isolation |
MACS MS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | for dendritic cell isolation |
Mouse CD4 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-049-201 | for CD4+ T cell isolation |
Mouse CD19 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-201 | for B cell isolation |
Mouse CD11c MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | for dendritic cell isolation |
Collagen type IV from human placenta | Sigma | C5533 | for MBMEC coating solution |
Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-5MG | for MBMEC coating solution |
Collagenase 2 (CSL2) | Worthington | LS004176 | for MBMEC isolation |
Collagenase/Dispase (C/D) | Roche | 11097113001 | for MBMEC isolation |
DNase I | Sigma | DN25 | for MBMEC isolation |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F7524 | for MBMEC isolation |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Amresco | 0332-100G | for MBMEC isolation |
Percoll | Sigma | P1644-1L | for MBMEC isolation |
DMEM (+ GlutaMAX) | Gibco | 31966-021 | for MBMEC isolation and MBMEC culture medium |
Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | for MBMEC isolation and MBMEC culture medium |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma | D8537 | for MBMEC and immune cell isolation |
Heparin | Sigma | H3393 | for MBMEC culture medium |
Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | PeproTech | 100-18B | for MBMEC culture medium |
Puromycin | Sigma | P8833 | for MBMEC culture medium; only for the first three days |
0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | for harvesting MBMECs |
Collagenase Type IA | Sigma | C9891 | for dendritic cell isolation |
Trypan Blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | for cell counting |
EDTA | Sigma | E5134 | for immune cell isolation |
IMDM + 1% L-Glutamin | Gibco | 21980-032 | for T cell culture medium |
X-VIVO 15 | Lonza | BE04-418Q | protect from light; for B cell culture medium |
β-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | for B cell culture medium |
L-Glutamine (100x Glutamax) | Gibco | 35050-061 | for B cell culture medium |
mouse MOG35—55 peptide | Biotrend | BP0328 | for antigen-specific T cell activation |
purified anti-mouse CD3 Ab | BioLegend | 100302 | clone 145-2C11; for polyclonal T cell activation |
purified NA/LE anti-mouse CD28 Ab | BD Pharmingen | 553294 | clone 37.51; for polyclonal T cell activation |
Recombinant Murine IFN-γ | PeproTech | 315-05 | for T-cell transmigration assays |
Recombinant Murine TNF-α | PeproTech | 315-01A | for T-cell transmigration assays |
NA/LE purified anti-mouse IFN-γ antibody | BD Biosciences | 554408 | clone XMG1.2; recommended final concentration: 20 µg/ml |
Granzyme B Inhibitor II | Calbiochem | 368055 | recommended final concentration: 10 µM |
PE anti-mouse CD4 antibody | Biolegend | 116005 | clone RM4-4; for analysis of T cell transmigration |