Drosophila oogenesis continues to be exceptionally useful in the study of mitochondrial proliferation and inheritance. This manuscript describes a detailed protocol used to label the replicating mitochondrial DNA (mtDNA) in Drosophila adult ovaries with 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (EdU), which facilitates uncovering mechanisms associated with mitochondrial inheritance that were previously debatable.
The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and transmitted from one generation to the next through the female oocyte is of fundamental importance. Because of the genetic tractability, and the elegant, ordered simplicity by which oocyte development proceeds, Drosophila oogenesis has become an invaluable system for mitochondrial study. An EdU (5-ethynyl-2´-deoxyuridine) labeling method was utilized to detect mitochondrial DNA (mtDNA) replication in Drosophila ovaries. This method is superior to the BrdU (5-bromo-2′-deoxyuridine) labeling method in that it allows for good structural preservation and efficient fluorescent dye penetration of whole-mount tissues.
Here we describe a detailed protocol for labeling replicating mitochondrial DNA in Drosophila adult ovaries with EdU. Some technical solutions are offered to improve the viability of the ovaries, maintain their health during preparation, and ensure high-quality imaging. Visualization of newly synthesized mtDNA in the ovaries not only reveals the striking temporal and spatial pattern of mtDNA replication through oogenesis, but also allows for simple quantification of mtDNA replication under various genetic and pharmacological perturbations.
핵 게놈 외에도, 각 진핵 세포는 미토콘드리아 매트릭스에서 작은 원형 DNA의 사본의 수천을 포함하고 있습니다. 미토콘드리아 DNA (미토콘드리아)은 전자 전달계의 필수 서브 유니트를 인코딩하는 동안, 복제 및 미토콘드리아 DNA의 전사에 대한 모든 요소를 포함하는 미토콘드리아 프로테옴의 대부분은 핵 유전자에 의해 코딩된다. 상속 멘델 법칙을 따른다 핵 게놈 달리, 동물 미토콘드리아 게놈은 모계를 통하여 독점적으로 상속된다. 따라서 미토콘드리아 DNA가 증식과 여성의 난자를 통해 한 세대에서 다음 세대로 전달하는 방법을 이해하는 것이 근본적으로 중요하다. 그러나, 미토콘드리아 DNA 복제가 여성 생식계에서 조절되는 방식을 계속 논의가있다. 또한, 미토콘드리아 전송을 위해 널리 미토콘드리아 병목 이론 원시 생식 세포에서 미토콘드리아의 인구가 비교적 적은 수 두린으로 서브 샘플링되는 것을 제안g 개발 1 2. 또한, 미토콘드리아 DNA 복제 시간적 및 공간적 oogenesis시 규제 것을 의미한다. 따라서, 배아 발달 동안 미토콘드리아 DNA 복제의 시츄 검출 미토콘드리아 유전 메카니즘의 이해를 용이하게한다.
초파리 oogenesis은 미토콘드리아 DNA의 복제 및 전송을 연구하는 유전자 다루기 쉬운 시스템을 제공한다. 두 초파리 난소 각각, 산란율의 기능적 단위 ovarioles 3이라고 달걀 챔버 16-20 독립적 문자열 (도 1a 참조)가있다. 각 ovariole은 앞쪽 끝이 germarium라는 구조로 구성되어있다 oogenesis의 진보적 인 선형 조직이 포함되어 있습니다. germarium 더 뚜렷한 발달 단계에서 배아 세포를 포함하는 4 개의 영역으로 구분된다. 제 1 지역에서, 배아 줄기 세포로 알려진 C 딸 세포를 생성하는 비대칭 분할 통과ystoblasts. 영역 (2a)는 최종 분할을 완료 한 cystoblasts이 포함되어 있습니다. Cystoblasts는 부문 생산 16 셀 그룹의 네 라운드를 받아야. 16 세포는 링 운하라는 세포질 다리로 서로 연결된 상태로 유지됩니다. 다른 15 배수체 간호사 세포로서 개발 중에 만 셀들 중 하나는 난자와 같은 분화 얻어. fusome라고도 필수적인 세포질 구조는, 링 수로의 형성을 촉진 낭종 극성 간호사 난자 세포 상호 작용 4,5-를 결정하는 것이 제안되어있다. 낭종이 영역 (2b)를 향해 이동함에 따라, 낭종 구조는 germarium의 전체 폭에 걸쳐,보다 모낭 세포와 관련된다. germarium 구조는 제 신진 달걀 챔버를 포함하는 영역 (3)으로 끝난다. 그 후, 달걀 챔버 (14) 형태 학적으로 서로 다른 단계에서 ovariole을 통해 진행 germarium의 뒤쪽 끝에서 조립된다. 모세포의 성장 WH 간호사 세포에 의존무형 문화 유산 수송 단백질의 mRNA와 난자에 링 운하를 통해 endomembrane 구조 (예를 들어, 골지). 초파리 oogenesis 동안, 각 16 세포 낭종 내의 미토콘드리아의 일부가 fusome과 관련이 있음을 발견, 링 운하를 통해 이동 Balbiani 바디 (6)라는 큰 질량에 하나의 난자에 전달했다. 이 현상은 여성의 난소 통하여 미토콘드리아 상속의 품질 관리에 기여하는 것이 제안되었다.
미토콘드리아 DNA 합성의 검출은 세포의 DNA에 표지 된 DNA의 전구 물질의 결합에 의존한다. 전통적으로, 티미 딘, 5- 브로 모 -2'- 데 옥시 우리 딘의 뉴 클레오 사이드 유사체 (BrdU의)은 조직 배양 세포에서 미토콘드리아 7,8 복제 라벨을 사용 하였다. 그러나, 항체 – 기초의 BrdU 라벨링 특히 전체 마운트 조직 염색을 위해, 몇 가지 제한을 나타낸다. BrdU의 라벨의 하나의 주요 단점은 노출 DNA 변성을 필요로한다는 것이다BrdU 양성 에피토프이를 방지 BrdU의 항체에 의해 검출 될 수 있도록. 시편은, 시편의 구조를 중단하고 다음 염색 절차 9 복잡 수 화학 물질 (예를 들면, 염산 또는 메탄올과 아세트산의 혼합물)의 DNase로, 열, 또는 분해 등의 가혹한 변성 조건 하에서 처리되어야 10.
여기서, 대안 티미 딘 유사체 5-에 티닐 -2'- 데 옥시 우리 딘 (EDU)은 초파리 성인 난소의 미토콘드리아 DNA 복제에 라벨을 사용한다. 이 방법은 빠르고 매우 민감하다. EDU는 쉽게 DNA 복제시 세포 DNA에 통합됩니다. 다음 검출은 "클릭"반응에 기초하는 구리 (I)은 단말기 알킨 기 및 형광 지드 (10) 사이의 공유 결합 반응을 촉매 반응. 반응이 시험편의 변성이 필요하지 않기 때문에 양호한 구조적 보존을 허용한다. 염료 (A)의 또 사이즈zide는 1/500 전체 실장 조직 빠르고 효과적인 침투를 가능하게하는 항체 분자 (10)의 그 것이다. 우리는 초파리 oogenesis 동안 미토콘드리아 DNA 복제를 감지하는이 방법을 사용하고 복제에 의존하는 미토콘드리아 DNA 선택적 상속 메커니즘을 제안하는 우리를 인도 초파리의 난소 (11)의 germarium 지역에서 눈에 띄는 공간 패턴을 발견했다. 우리는 여기에서 초파리의 난소에서 미토콘드리아 DNA 복제의 듀 표시에 대한 자세한 프로토콜을 제시한다. (: 너도 알면서 T300I 산) (11)뿐만 아니라 잠재적 인 미토콘드리아 막을 분산하고 잠재적으로 미토콘드리아 DNA 복제를 방해 미토콘드리아 uncouplers, 다양한 치료 프로토콜의 응용 프로그램을 설명하기 위해, 우리는 또한 미토콘드리아 DNA a를 미토콘드리아 DNA 돌연변이 초파리에서 복제를 테스트했다.
EDU 라벨링 신규 합성 DNA에 혼입 및 뉴 클레오 시드 유사체의 염색에 기반 증식 세포에서 DNA 합성을 검출하기위한 신규하고 효과적인 방법이다. 이 방법은 빠르고 매우 민감한 점에서의 BrdU 라벨링 방법보다 우수하다. 더욱 중요한 것은 10. 역사적 BrdU의 라벨링에 우수한 대안으로, 듀 표시는의 S-단계에서 핵 DNA 복제를 연구에 사용 된, 조직 (9)를 장착 전체적으로 양호한 구조적 보전 효율적 듀 염색 침투를 허용 세포주기. Aphidicolin는 S 단계 12-15에서 핵 DNA 복제의 주요 효소 인 DNA 폴리머 라제 α의 억제제이다. 미토콘드리아 DNA의 복제 처리 aphidicolin 둔감하다 DNA 폴리머 라제 γ에 의해 수행된다. 따라서, 이전에와 듀 배양 동안 aphidicolin 치료는 크게 핵 DNA에 듀 설립을 억제 하였다. 그것은해야적절하게 저장, 핵 DNA 복제를 억제 aphidicolin의 효능은 우리의 손에 변수 인 경우 aphidicolin 몇 주 동안 안정 수도있다. 추가 데이터 분석에서 강한 핵 DNA 표지와 ovarioles 또는 달걀 챔버는 제외한다.
미토콘드리아 DNA의 복제를 용이하게 또한 세포질 총 부피로 정규화 듀 puncta의 수를 카운트함으로써 미토콘드리아 DNA 복제의 수준을 정량화하기위한 간단한 방법을 수득 세포질에서 puncta에 같이 시각화 될 수있다. 이미징 소프트웨어는 자동으로 큰 데이터 세트의 계산 분석에 특히 유용 현미경 이미지에서 듀 puncta의 식별에 적용될 수있다. 핵 DNA 복제의 불완전 억제 염색체에 별개의 궤적에서 듀 통합으로 이어질 및 핵 내부 puncta에로 표시 할 수 있기 때문에,주의 사항,주의해야한다. 또한 다른 경우, 에듀의 강도는 repli에 혼입배경과 소음이 높은이 될 수있는 동안 상호간의 미토콘드리아 DNA는 약한 될 수 있습니다. 따라서, 자동 이미지 분석에 대한 개별 매개 변수는 신중하게 정의되어야한다. 또한 이미지가 적절한 듀 puncta의 식별되어 있는지 확인하기 위해 훈련 된 눈으로 검사하는 것이 좋습니다.
초파리 oogenesis 동안 새로 합성 된 미토콘드리아의 시각화 미토콘드리아 DNA 복제가 약리 유전 또는 섭동 다양한 실시 파리의 실험을 수행하여, 생리적 또는 병리 적 상태에 의해 규제되는 방법을 조사 할 기회를 제공한다. 너도 알면서 T300I 11 : 이전의 연구에서, EDU의 통합 분석은 미토콘드리아 DNA 돌연변이 초파리 산에서 수행되었다. 또한, 미토콘드리아 막 잠재력을 방해하기 위해, 난소은 미토콘드리아 uncoupler FCCP 또는 2,4- 디 니트로 페놀 (DNP) 이전 에듀에 통합의 다양한 농도로 처리 하였다. 실험 목적에 따라약물의 특성은 다른 방법이 효과적인 전달을 위해 채택 될 수 있습니다. 성인 초파리를 들어, 약물이 증기 (예를 들면, 에탄올 및 코카인)로 표현 될 수있다 (16, 17) 또는 약물이 신속하게 본체 (18)에 걸쳐 확산되어 복부에 주입 될 수있다. 가장 일반적인 방법은 약물 즉석 식품 또는 수크로오스 / 약물로 포화 된 여과지에 첨가된다는 것이다. 예를 들어, 미세 소관 조립체 콜히친의 억제제, 난소 절제술 19 전 2-3 일 동안은 파리에 공급 하였다. 따라서, 상기 약물 전달 방법을 평가하고 적절한 농도를 선택하는 것이 중요하다.
초파리의 난소에서 미토콘드리아 DNA 복제의 성공 이미징을 보장하기 위해 몇 가지 중요한 단계는 신중하게 실행해야합니다. 제일, 해부 및 에듀 통합 동안 난소의 생존과 건강을 유지하는 것은 필수적이다 (1 단계와 2 단계). FBS와 슈나이더의 초파리 배지 RT로 가온 할 필요사용하기 전에. 하나는 계란 챔버 및 해부 도구 또는 피펫 팁 사이의 직접 접촉을 최소화해야한다. 난소는 탈수를 방지하기 위해 솔루션에서 모든 시간을 몰입해야한다. 조직이 쉽게 발생할 수 있습니다 잘못 취급하면 희미하거나 더 형광 신호합니다. 조직 마운팅 공정 중에 ovarioles들은 서로 분리되어야하며, 현미경 슬라이드에 퍼져. 계란 챔버가 서로 위에 쌓인 않았는지 확인하십시오. 우리는 단 14 이상으로 계란 챔버가 작은 듀 통합을 표시 것으로 나타났습니다. 또한, 때문에 큰 크기의 후반 단계 달걀 챔버는 종종 이웃 젊은 달걀 챔버의 초점이 맞지 원인. 따라서 후반 단계 달걀 챔버 폐기하는 것이 좋습니다.
여기에서 우리는 초파리 성인 난소에서 미토콘드리아 DNA를 복제 표시에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 이 방법은 다양한 유전 적 및 약리학 섭동하에 미토콘드리아 DNA 복제의 간단한 정량 허용발달 미토콘드리아 생물 및 미토콘드리아 DNA 상속을 기본 메커니즘을 해부하는 데 유용 할 것입니다.
The authors have nothing to disclose.
We thank K. Delaney for comments on the manuscript. This work was supported by the National, Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) Intramural Program.
Schneider’s Drosophila medium | Invitrogen | 21720-024 | |
FBS | Invitrogen | 10100-147 | |
Pair of Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
Aphidicolin | Sigma | A0781 | Aliquot after dissolving in DMSO. Avoid repetitive thawing and freezing. Protect from light. May be used within 6 weeks after dissolving. |
FCCP | Sigma | C2920 | |
DMSO | Sigma | D2650 | |
Paraformaldehyde, 16% EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood with skin and eye protection. |
PBS | KD Medical | RGF-3190 | |
BSA | Sigma | A7030 | |
Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Invitrogen | C10337 | EdU, CuSO4, Alexa Fluor 488 azide, EdU reaction buffer and Edu buffer additive are included |
Mouse ATP synthase subunit α antibody, (15H4C4) | MitoSciences | Ab14748 | 1:1000 dilution |
Mouse Hts antibody (clone RC) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | hts RC | 1:1000 dilution |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 568 secondary antibody | Invitrogen | A-11004 | 1:200 dilution |
Vectashield mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
Glass coverslips, #1.5 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-541-B | |
Microscope slide | Fisher Scientific | 22-038-103 | |
Nail polish | Elf | Many of the pigments used in nail polishes are fluorescent and leach into specimens. Only clear nail polish should be used. |