Summary

Concepção e utilização de um baixo custo, Automated Morbidostat para Adaptive Evolução das bactérias sob Antibiótico Seleção de Drogas

Published: September 27, 2016
doi:

Summary

We describe a low cost, configurable morbidostat that enables the characterization of antibiotic drug resistance by dynamically adjusting the drug concentration. The device can be integrated with a multiplexed microfluidic platform. The approach can be scaled up for laboratory antibiotic drug resistance studies.

Abstract

Descreve-se um baixo custo, morbidostat configurável para a caracterização da via evolutiva da resistência aos antibióticos. O morbidostat é um dispositivo de cultura bacteriana que monitora continuamente o crescimento bacteriano e ajusta dinamicamente a concentração da droga para desafiar constantemente as bactérias à medida que evoluem para adquirir resistência aos medicamentos. O dispositivo dispõe de um volume de trabalho de ~ 10 mL e é totalmente automatizado e equipado com medição de densidade óptica e micro-bombas para médio e entrega de droga. Para validar a plataforma, medimos a aquisição gradual de resistência trimetoprim em Escherichia coli MG 1655, e integrada com o dispositivo de microfluidos de uma plataforma multiplexado para investigar a morfologia das células e sensibilidade aos antibióticos. A abordagem pode ser up-dimensionado para estudos laboratoriais de resistência aos medicamentos antibióticos, e é extensível para adaptativa evolução de melhorias de tensão em engenharia metabólica e outros experimentos de cultura bacteriana.

Introduction

Desde a introdução da primeira penicilina antibiótico, a resistência aos antibióticos microbiana tornou-se um problema de saúde global 1. Embora a aquisição de resistência a antibióticos pode ser retrospectivamente estudados in vivo, as condições destas experiências muitas vezes não são controlados ao longo de toda a evolução 2. Alternativamente, evolução adaptativa laboratório pode revelar a evolução molecular de uma determinada espécie microbiana sob stresses ambientais ou pressão de seleção de um medicamento antibiótico 3. Recentemente, muitas experiências evolutivas bem controlados de resistência aos medicamentos antibióticos elucidaram o surgimento de resistência aos medicamentos antibióticos. Por exemplo, o grupo de Austin demonstrado surgimento rápido num ambiente compartimentado microfluidos adequadamente manipulado 4. O morbidostat recentemente desenvolvido induz a mutações sistemáticas sob droga pressão de seleção 5,6. O morbidostat, uma selec microbianação dispositivo que ajusta continuamente a concentração de antibiótico para manter uma população praticamente constante, é um grande avanço a partir do teste de flutuação utilizado em microbiologia 7,8. No teste de flutuação, uma droga antibiótica é injectada a alta concentração, e os sobreviventes mutantes são rastreadas e contadas. Em vez disso, os micróbios em um morbidostat são constantemente desafiados e adquirir múltiplas mutações.

O morbidostat opera de forma semelhante ao quimiostato, cultura de um dispositivo inventado por Novick e Szliard em 1950 que mantém uma população constante através do fornecimento de nutrientes continuamente enquanto que a diluição da população microbiana 9. Desde a sua introdução, o quemostato tem sido avançado e melhorado. quimiostatos microfluídicos em curso alcançaram capacidades nanolitros e de uma única célula. No entanto, estes dispositivos não são adequados para experiências evolução adaptativa, que necessitam de uma população de células grandes com muitos eventos de mutação 10,11. Recentemente, mini-quimiostatos com volumes de trabalho de ~ 10 ml também foram desenvolvidos para preencher a lacuna entre biorreatores em escala litro eo microfluídico quemostato 12,13.

Aqui apresentamos a concepção e utilização de um baixo custo, morbidostat automatizado para um estudo de resistência aos medicamentos antibióticos. O módulo proposto pode ser empregue num incubador agitador de laboratório com microbiologia requisito mínimo de hardware. O firmware open-source também é facilmente adaptado para aplicações específicas de evolução adaptativa, tais como engenharia metabólica 3. Finalmente, o morbidostat é integrado em uma plataforma microfluídica multiplexado para testes de sensibilidade aos antibióticos 14.

Protocol

1. Montagem e pré-teste do dispositivo Morbidostat Assembleia da Morbidostat Soco 3 furos na tampa do frasco de cultura com uma agulha de seringa 18 G. Corte três peças de tubagem de polietileno ~ 7 cm de comprimento. Inserir essas três pedaços de tubos de polietileno na tampa. Use fita para envolver a borda da tampa para servir como o elenco para a mistura de polidimetilsiloxano (PDMS). Dissolvem-se 5 g de componente A e 0,5 g de componente B de o PDMS em um recipiente de plástico de…

Representative Results

O morbidostat acima descrito está esquematizado na Figura 1. As operações morbidostat comuns, incluindo a evolução experimental, teste de susceptibilidade aos antibióticos e a morfologia das células de controlo, foram validados em uma E. coli MG1655 cultura exposta ao trimetoprim (TMP), um fármaco antibiótico comumente utilizado 5,6. TMP induz aumentos graduais muito distintas em resistência aos medicamentos, e as mutações são agrupados e…

Discussion

Um dispositivo morbidostat baixa pegada de componentes de baixo custo é demonstrada. Os aumentos no nível de resistência a drogas registadas pelo dispositivo são consistentes com os dos relatórios anteriores 5. Concebido para estudos evolutivos de resistência a drogas, o dispositivo é potencialmente aplicável a muitas outras experiências. Primeiro, um banco de dados abrangente de mutações induzidas pela droga pode ser estabelecido para um grande conjunto de antibióticos clinicamente relevantes. Po…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to thank Prof. Sze-Bi Hsu and Ms. Zhenzhen for useful discussions and help in the theoretical analysis and numerical simulation. Y. T. Y. would like to acknowledge funding support from the Ministry of Science and Technology under grant numbers MOST 103-2220-E-007-026 and MOST 104-2220-E-007-011, and from the National Tsing Hua University under grant numbers 103N2042E1, 104N2042E1, and 105N518CE1.

Materials

Environmental Shaker Incubator BioSan ES-20
Arduino Leonardo board Arduino Leonardo
680 Ohm Carbon Resistor Digikey Bias resistor for LED
100k Ohm Carbon resistor Digikey Bias resistor for phototransistor
940 nm light emitting diode Bright LED Electronic BIR-BM13E4G-2 Optical density measurement
940 nm phototransistor Kodenshi  ST-2L2B Optical density measurement
Darlington pair IC Toshiba Mouser ULN2803APG  this IC drives micropumps and magnetic stirring unit
5V DC brushless fan  ADDA AD0405LX-G70 spec: 5V supply voltage and 80mA available www.jameco.com
Piezoelectric micropump CurieJet PS15I-FT-5L Pressure >3kPa  Flow rate >5 ml/min
Tygon 3350 Tuning Saint Gobain ABW00001 ID: 1/32" OD: 3/32" L:50' 
Magnetic Stir bar COWIE tapered shape dim: 10 mm x 4mm
Glass scintillation 20ml vial DGS Pyrex glass 28mm(dia.)x 61 mm(h)
Culture vial holder Custom made from Polyformaldehyde 
Silicone  Dow Corning Sylgald 184 used to seal the glass vial
Medium bottle VWR 66022-065
Difco M9 minimal salt 5x BD Medium
Cadamino Acid BD Medium
glucose Sigma
Agar Bateriological Oxoid for agar plate
Luria Bertani medium
Inverted microscope Leica Microsystems Leica DMI-LED used for microfluidic measurement Use X40 objective NA=0.55
Microscope Incubator Live Cell Instrument CU-109 used for microfluidic measurement
Solenoidal valves Pneumadyne S10MM-31-12-3 Normally open 1.3 Watt 12 Vdc
USB interface card Hobby Engineering USBIO24-R Digital I/O Module  for microfluidics measurement
Air compressor Rocker Scientific ROCKER 440 Pressure source for microfluidcs Max. Pressure 80 Psi
Male luer-lock fittings to 1/8" barb ValuePlastics.com MTLL230-1 used for microfluidic control
1/8" barb to 10-32 threaded port ValuePlastics.com B-1 used for microfluidic control
Female luer-lock fittings to 10-32 threaded port ValuePlastics.com KFTL-1 used for microfluidic control
NPN darlington transistor 500mA, 40V (2N6427) DigiKey.com 2N6427GOS-ND used for microfluidic control
10kOhm, carbon film resistor, 0.25W DigiKey.com P10KBACT-ND used for microfluidic control
Tantalum capacitor, 10uF, 25V, 10% DigiKey.com 478-1841-ND used for microfluidic control
Andor CCD camera Andor Zyla 4.2 Plus SCMOS used for microfluidic on chip imaging
ELISA plate reader
two component Silicone  Momentive RTV 615 used for microfluidic chip fabrication
SU-8 photoresist Micrchem SU8 2015 used for microfluidic chip fabrication
AZ4620 photoresist Clariant AZ 4620 used for microfluidic chip fabrication
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC 32G used for microfluidic chip fabrication
20 Gauge Syringe Needle BD used for microfluidic chip fabrication
Labcycler Sensoquest Labcycler PCR 
DNA polymerase Toyobo KDO Plus PCR amplification
Trimethoprim Sigma
Plate reader Biotek Synergy H1 hybrid  antibiotic resistane measurement

Referenzen

  1. Levy, S. B., Marshall, B. Antibiotic resistance worldwide: causes, challenges, and responses. Nat. Med. 10, s122-s129 (2004).
  2. Wang, M. M., et al. Tracking the in vivo evolution of multidrug resistance in Staphylococus aureus by whole genome sequencing. Pro. Natl. Acad. Sci. 104, 9451 (2007).
  3. Dragosits, M., Mattanovich, D. Adaptive laboratory evolution – principles and applications for biotechnology. Microbial Cell Factory. 12, 64 (2013).
  4. Zhang, Q., et al. Acceleration of emergence of bacterial antibiotic resistance in connected microenvironment. Science. 333, 1764-1767 (2011).
  5. Toprak, E., Veres, A., Michel, J. B., Chait, R., Hartl, D. L., Kishony, R. Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nature Genetics. 44, 101-106 (2012).
  6. Toprak, E., et al. Building a morbidostast: an automated continuous culture device for studying bacterial drug resistance under dynamically sustained drug inhibition. Nature Protocol. 8, 555-567 (2013).
  7. Rosenthal, A. Z., Elowitz, M. B. Following evolution of bacterial antibiotic resistance in real time. Nature Genetics. 44, 11-13 (2012).
  8. Young, K. In vitro antibacterial resistance selection and quantitation. Curr Protoc Pharmacol. , (2006).
  9. Novick, A., Szilard, L. Experiments with the Chemostat on spontaneous mutations of bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 708-719 (1950).
  10. Balagadde, F. K., You, L., Hansen, C. L., Arnold, F. H., Quake, S. R. Long-term monitoring of bacteria undergoing programmed population control in a microchemostat. Science. 309, 137-140 (2005).
  11. Groisman, A., et al. A microfluidic chemostat for experiments with bacterial and yeast cells. Nat. Methods. 2, 685-689 (2005).
  12. Miller, A. W., Befort, C., Kerr, E. O., Dunham, M. J. Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays. J. Vis. Exp. (72), e50262 (2013).
  13. Takahashi, C. N., Miller, A. W., Ekness, F., Dunham, M. J., Klavins, E. A low cost, customizable turbidostat for use in synthetic circuit characterization. ACS Synthetic Biology. , (2015).
  14. Mohan, R., et al. A multiplexed microfluidic platform for rapid antibiotic susceptibility testing. Biosens Bioelectrons. 49, 118-125 (2013).
  15. Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288, 113-116 (2000).
  16. Kellogg, R. A., Gomez-Sjoberg, R., Leyrat, A. A., Tay, S. . Nat. Protocols. 9, 1713 (2014).
  17. Gu, G. Y., Lee, Y. W., Chiang, C. C., Yang, Y. T. A nanoliter microfluidic serial dilution bioreactor. Biomicrofluidics. 9, 044126 (2015).
  18. Gonzalez, R. C., Woods, R. E., Eddins, S. L. . Digital image using Matlab processing. , (2004).
  19. Heikkila, E., Sundstrom, L., Huovinen, P. Trimethoprim resistance in Escherichia coli isolates from a geriatric unit. Antimicrob. Agents Chemother. 34, 2013-2015 (1990).
  20. Flensburg, J., Skold, O. Massive overproduction of dihydrofolate reductase in bacteria as a response to the use of trimethoprim. Eur. J. Biochem. 162, 473-476 (1987).
  21. Ohmae, E., Sasaki, Y., Gekko, K. Effects of five-tryptophan mutations on structure, stability and function of Escherichia coli dihydrofolate reductase. J. Biochem. 130, 439-447 (2001).
  22. Smith, D. R., Calvo, J. M. Nucleotide sequence of dihydrofolate reductase genes from trimethoprim-resistant mutants of Escherichia coli. Evidence that dihydrofolate reductase interacts with another essential gene product. Mol. Gen. Genet. 187, 72-78 (1982).
  23. Okumus, B., Yildiz, S., Toprak, E. Fluidic and microfluidic tools for quantitative systems biology. Curr Opin Biotech. 25, 30-38 (2014).
  24. Cho, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Sci. Transl. Med. 17, 267 (2014).
  25. Hsu, S. B., Waltman, P. E. Analysis of a model of two competitors in a chemostat with an external inhibitor. SIAM J. Applied Math. , 528-540 (1992).
  26. Fu, W., et al. Maximizing biomass productivity and cell density of Chlorella vulgaris by using light-emitting diode-based photobioreactor. J. Biotech. 161, 242-249 (2012).
  27. Peabody, V. G. L., Winkler, J., Kao, K. C. Tools for developing tolerance to toxic chemicals in microbial systems and perspectives on moving the field forward and into the industrial setting. Curr Opin in Chem Eng. 6, 9-17 (2014).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Liu, P. C., Lee, Y. T., Wang, C. Y., Yang, Y. Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection. J. Vis. Exp. (115), e54426, doi:10.3791/54426 (2016).

View Video