A high-throughput microarray method for the identification of polymers which reduce bacterial surface binding on medical devices is described.
Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as contributing to antimicrobial resistance. One possible avenue for the reduction of device-associated infections is the identification of bacteria-repellent polymer coatings for these devices, which would prevent bacterial binding at the initial attachment step. A method for the identification of such repellent polymers, based on the parallel screening of hundreds of polymers using a microarray, is described here. This high-throughput method resulted in the identification of a range of promising polymers that resisted binding of various clinically relevant bacterial species individually and also as multi-species communities. One polymer, PA13 (poly(methylmethacrylate-co-dimethylacrylamide)), demonstrated significant reduction in attachment of a number of hospital isolates when coated onto two commercially available central venous catheters. The method described could be applied to identify polymers for a wide range of applications in which modification of bacterial attachment is important.
Polymer microarrays er miniaturiserede high-throughput platforme, hvor op til 7.000 polymerer 1 er trykt på objektglas til parallel analyse med prokaryote eller eukaryote celler 2. Fremgangsmåden præsenteres her bygger på det, som vi først beskrevet i 2010 3. Denne screening system er blevet anvendt på en lang række celletyper, herunder humane hepatocytter 4, stamceller 5, renale tubulære epitelceller 2, bakterier 3,6 og protozopatogener 7. I hvert tilfælde blev polymerer, der fremmer eller modstå bindende af cellerne under undersøgelsen identificeret otte. Komplekser af DNA med syntetiske polykationiske polymerer er også blevet anvendt i mikroarrayformat for high-throughput screening af gentransfektion kandidater 9. Samt screening for celle-substrat-interaktioner, har polymer microarrays også blevet anvendt til evaluering materialeegenskaber 10.
"> Evnen af syntetiske polymerer til at modulere binding af bakterier til en overflade er veletableret 3,6,11. Talrige faktorer, herunder ladning, hydrofobicitet og overfladeruhed polymeroverfladen er kendt for at påvirke bakterielle bindende. De konventionelle metoder til at opdage biomaterialer at modstå binding af bakterier gennem sekventielt eller empirisk designe og teste ét materiale ad gangen er arbejdskrævende, kostbare og tidskrævende processer. Polymer microarrays tilbyde et attraktivt alternativ til at omgå sådanne begrænsninger.Overfladeaktive-associerede bakterier vokse som en kompleks population kaldes en biofilm – sådanne biofilm er meget resistente over mange miljømæssige belastninger og antibiotika. Dette er til dels på grund af deres tætte ekstracellulære matrix (bestående af proteiner, polysaccharider og nukleinsyrer) 12 og dels på grund af den øgede tilstedeværelse af robuste "persistor" celler i biofilm 13. although de præcise mekanismer overflade forening og efterfølgende biofilmdannelse er vanskelige at karakterisere, er det generelt mente, at der er tre forskellige stadier af overflade vækst 14-16. Initial, reversibel vedhæftning efterfølges af stærkere vedhæftning af celler, etablering af en biofilm ved produktion af et ekstracellulært protein og polysaccharid matrix og celleproliferation. Endelig de modne biofilm frigiver fritlevende planktoniske celler, som kan initiere nye infektioner andre steder. Bakterier-frastødende polymerer, som forhindrer den oprindelige binding af bakterier, og dermed forhindrer tidlige stadier af biofilmdannelse, repræsenterer potentielt en fremragende løsning til minimering infektioner. I betragtning af den stigende antibiotikaresistens (og også den iboende større modstand af overflade-associerede bakterier 12), antibiotika-fri middel til at reducere infektioner er af særlig interesse. I et hospital, bakterier-frastødende polymerbelægninger kan have en direkte medicinsk anvendelse i reduktionen af nosokomielle infektioner, som almindeligvis dannes omkring implanterede anordninger 17.
Her er en høj-throughput fremgangsmåde til screening af 381 polymerer til afvisende aktivitet mod en række patogene bakterier forbundet med nosokomielle infektioner, efterfulgt af hit validering og efterfølgende coating og assay af centralt venekateter materialer, beskrevet (figur 1). Kort fortalt blev polymererne plettet på agarose-coatede objektglas ved kontakt trykning og, efter tørring og sterilisering blev de miniaturiserede arrays inkuberet med klinisk vigtige bakteriekulturer. Efter inkubation blev microarrays forsigtigt vasket og adhærerende bakterieceller blev farvet og visualiseret ved fluorescens. Efterfølgende blev polymerer, der inhiberede bakteriel binding undersøgt i større målestok ved overtrækning på dækglas og visualiseret ved elektronmikroskopi. Valgt repellånte polymerer blev derefter coatet på kommercielle katetre og vist at reducere binding af bakterier ved næsten 100 gange.
Fastgørelse af bakterier på en overflade er en kompleks proces bestemt af en lang række faktorer afhængig af de bakteriearter, egenskaberne af overfladen, det omgivende medium og det fysiske miljø. Selvom visse kemiske grupper er kendt for at påvirke bakterielle binding (polyglycoler, for eksempel typisk modstå fastgørelse 11), korrelering af biologiske indvirkning polymerer med deres kemiske strukturer er vanskeligt, hvilket gør rationelt design af polymerer til specifikke funktioner udfordrende. I mangel af detaljerede fastgørelsesmekanismer, har andre undersøgelser forsøgt at efterligne naturligt forekommende frastødende overflader, med langvarig og omfattende optimering processer 21. Den miniaturiserede high-throughput metode præsenteres her overvinder disse udfordringer ved at lette parallel screening af hundredvis af polymerer til at identificere leads til yderligere undersøgelse.
Resultater fra microarray metode hovedsageligt tjener til IDEntify sandsynligt føre kandidater. Figur 2 illustrerer 22 kandidater med lav binding af mindst én art, mens figur 3 viser tydelig reduktion i bindingskapacitet. Alle 22 lav-bindende polymerer er vist i i Figur 2 blev taget frem til scale-up eksperimenter, hvorunder det bedste (i form af Repellence og overtræksegenskaber) blev bestemt til at være PU83, PA13, og PA515 (figur 4 og 5). Polyacrylater giver større fleksibilitet med hensyn til polymerisationsmetoder og så den laveste bindende polyacrylat, PA13, blev valgt til kateter belægning undersøgelser (figur 6 og 7). Mere detaljeret videre arbejde med andre kandidater blev udført og er blevet rapporteret andetsteds 6.
Gennem en række eksperimentelle iterationer fandt vi en række mindre skridt var nøglen til succes og reproducerbarhed. Samt lette adhæsionen afpolymerer til objektglas ved brug af en agarose under-belægning giver en ren baggrund, som agarose er meget modstandsdygtigt over for bakteriel kolonisering. Ligeledes konsistens i polymeren blev selv, både inden for samme array og mellem arrays, er afgørende, og derfor trykningen af de arrays skal omhyggeligt kontrolleres. Omhyggelig justering af stifterne i print-hoved og også ensartet fyldning af 384 brønde er forpligtet til at sikre ensartet spotting. Som nogle af polymererne vi anvendte udviste en vis grad af autofluorescens under baggrund fluorescensdata for hvert objektglas før inkubation med bakterier var afgørende. For at tage højde for variationer og for at opnå robuste data gentagelser af mikroarrays rådes.
Den anvendes her farvning (DAPI) har ingen selektivitet for bakteriearter, bindende ikke-specifikt til DNA. Derfor god aseptisk teknik er afgørende, når bakteriekulturer introduceres som forureninger kan gå upåagtet hen, forvirrende fortolk-førelsen af resultaterne. Det samme gælder for senere eksperimenter under anvendelse af scanningselektronmikroskopi, hvor det kun er muligt at skelne stænger og kokker, men ikke slægt eller art.
Efter microarray screening, bør lovende polymerer vælges for yderligere validering. I eksemplet præsenteret her blev syv polymerer af interesse identificeres ved deres klar reduktion i fluorescens på mikroarrayet og deres inhibering af binding blev bekræftet ved at coate dem på større flader. Figur 4 og 5 viser reduktionen i binding opnået på dækglas, en praktiske midler til at teste opførslen af polymererne bulk overtræk snarere end som microarray pletter. Efterfølgende blev disse polymerer belagt på medicinsk udstyr til fuldt ud at kvantificere reduktion i bakteriel vedhæftet fil. Det er vigtigt, at opløsningsmidlet vælges (se protokol afsnit 8) for disse coating studier er godartet til den ønskede substrat (her kateteret), mens beholdeing evne til at opløse polymeren af interesse, for at tillade belægning. Her anvendte vi acetone, der, såvel som egenskaberne nævnt, har et lavt kogepunkt og fordamper hurtigt til at give en ensartet coating.
Midlerne til validering valgt, vil afhænge af den specifikke anvendelse, der undersøges. Som observation af celler ved elektronmikroskopi og fluorescens mikroskopi giver mulighed for direkte kvantificering af enkelte celle vedhæftet fil, vi valgte disse teknikker som et supplement til bulk farvning microarray analyse. Resultater er vist i figur 6 og 7, som viser, hvor vigtigt det gratis valideringsmetoder. De konfokale billeder i figur 6 giver meget klare billeder af individuelle celler, mens SEM har den ekstra fordel, at en vurdering af overfladen af polymeren, som er her glat og ensartet. Disse fremgangsmåder er begrænset af synsfeltet af mikroskoper anvendte, og det er derfor important til at tage en række snapshots til at have tillid til resultaterne. Den ovenfor beskrevne fremgangsmåde kan ikke kvantificere bakteriel adhærens over hele overfladen, kun udlede dækning fra en række af små regioner. Vi mener, at dette er tilstrækkeligt for anvendelsen beskrevet. Reduktion i bakteriel binding kunne vurderes ved optælling klæbet bakterier på hele og uden overtræk kateter stykker med metoder som beskrevet andetsteds 22. Sådanne fremgangsmåder kræver biomaterialet overflader screenet med ensartede overfladeareal, som er vanskeligt at opretholde, når analyser udføres med medicinsk udstyr, der ofte har kompleks geometri.
Det er klart, skal enhver anordning bestemt til klinisk brug gennemgår betydelige yderligere test for at sikre sikkerhed og effektivitet i mennesker. Fremgangsmåden præsenteres her repræsenterer begyndelsen af denne proces og yderligere arbejde skal omfatte bekræftelse af in vivo-aktivitet. I dette tilfælde studerer venøs catheters, indledende arbejde kunne undersøge bindingen af blodkomponenter og hele celler til polymeren. Bør også overvejes Effekten af blodkomponenter på bakteriel binding, eventuelt ved at gentage de bindende assays i tilstedeværelsen af inaktiveret serum eller de-fibrinated blod 23. Den endelige test af teknologi ske i en in vivo model, såsom et subkutant implantat infektion model 24.
Vi demonstrerer potentialet af polymeren microarray metode til screening af overfladen-ændring polymerer. Sådanne polymerer (både modstand og fremmer bakteriel binding) har et stort antal ansøgninger inden for medicin, fødevareindustrien og bioteknologi, hvilket betyder denne metode kan være nyttig i mange forskningsområder. Selv om arbejdet her anvender bakterier, kunne fremgangsmåden tilpasses til andre celletyper og ligeledes andre kemiske microarrays.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank EASTBIO (the East of Scotland BioScience Doctoral Training Partnership funded by the BBSRC) (S. V.) and the Medical Research Council (P.J.G) for funding.
Agarose | Sigma | 05066 | |
Silane-prep slides | Sigma | S4651 | |
Polymers | Synthesised in-house | Not applicable | |
NMP | Sigma | 494496 | |
LB Broth | Oxoid | CM1018 | |
DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
Tetrahydrofuran | Sigma | 401757 | |
(3-aminopropyl) triethoxysilane coated glass slides | Sigma | Silane-prep | |
Cacodylate buffer | Sigma | 97068 | |
Catheter 1 | Arrow International | CS12123E | |
Catheter 2 | Baxter Healthcare | ECS1320 | |
Osmium tetroxide | Sigma | 201030 | |
Equipment | |||
Contact printer | Genetix | Qarraymini | |
Microarray microscope | IMSTAR | Pathfinder | |
Spin Coater | Speedline Technologies | 6708D | |
Confocal microscope | Leica | SP5 | |
Image analysis software | Media Cybernetics | Image-Pro Plus | |
Scanning electron microscope | Philips | XL30CP | |
Sputter coater | Bal-Tec | SCD050 |