We introduce the VacuSIP, a simple, non-intrusive, and reliable method for clean and accurate point sampling of water. The system was developed and evaluated for the simultaneous collection of the water inhaled and exhaled by benthic suspension feeders in situ, to cleanly measure removal and excretion of particulate and dissolved compounds.
Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and detritus, and excreting particulate and dissolved compounds, they serve as important agents for benthic-pelagic coupling. Accurately measuring the compounds removed and excreted by suspension feeders (such as sponges, ascidians, polychaetes, bivalves) is crucial for the study of their physiology, metabolism, and feeding ecology, and is fundamental to determine the ecological relevance of the nutrient fluxes mediated by these organisms. However, the assessment of the rate by which suspension feeders process particulate and dissolved compounds in nature is restricted by the limitations of the currently available methodologies. Our goal was to develop a simple, reliable, and non-intrusive method that would allow clean and controlled water sampling from a specific point, such as the excurrent aperture of benthic suspension feeders, in situ. Our method allows simultaneous sampling of inhaled and exhaled water of the studied organism by using minute tubes installed on a custom-built manipulator device and carefully positioned inside the exhalant orifice of the sampled organism. Piercing a septum on the collecting vessel with a syringe needle attached to the distal end of each tube allows the external pressure to slowly force the sampled water into the vessel through the sampling tube. The slow and controlled sampling rate allows integrating the inherent patchiness in the water while ensuring contamination free sampling. We provide recommendations for the most suitable filtering devices, collection vessel, and storing procedures for the analyses of different particulate and dissolved compounds. The VacuSIP system offers a reliable method for the quantification of undisturbed suspension feeder metabolism in natural conditions that is cheap and easy to learn and apply to assess the physiology and functional role of filter feeders in different ecosystems.
Bunnhenge matere spille viktige roller i funksjon av marine økosystemer 1. Ved å filtrere store mengder vann 2,3, de fjerner og skille ut partikler (plankton og detritus) og oppløste forbindelser 1 (og referanser deri), og er et viktig middel for bentisk-pelagisk kopling 4,5 og næringsstoff sykling 6,7. Nøyaktig måling av partikler og oppløste forbindelser fjernet og utskilles av bunn suspensjon brett (som svamper, sjøpung, børstemark og muslinger) er grunnleggende for å forstå deres fysiologi, metabolisme, og fôring økologi. Sammen med pumping hastighetsmålinger, gjør det også en tallfesting av nærings flukser mediert av disse organismene og deres økologiske innvirkning på vannkvaliteten så vel som på økosystemet skala prosesser.
Velge den riktige metoden for å måle fjerning og produksjonsrater av partikler og oppløst compounds av henge filter feeders er avgjørende for å skaffe pålitelige data om deres fôring aktivitet 8. Som påpekt av Riisgård og andre, upassende metoder skjevhet resultater, forvrenge eksperimentelle forhold, produsere uriktige beregninger av inntak og utskillelse av visse stoffer, og kan føre til feilaktig tallfesting av nærings flukser behandles av disse organismene.
De to hyppigst benyttede metoder for å måle partikler og oppløste næringsstoffer flukser i filter feeders bære enten inkubasjon (indirekte teknikk) eller samtidig samling av ambient og pustet ut vann (direkte teknikker). Ruge teknikkene er basert på måling av hastigheten av endring i konsentrasjonen av partikler og oppløste næringsstoffer i inkubert vann, og å estimere forekomsten av produksjon eller fjerning sammenlignet med betryggende kontroll 8. Men omslutter en organisme i en inkubasjon kammer kan endre sin feeding og pumping oppførsel på grunn av endringer i den naturlige strømningsregime, på grunn av en nedgang i oksygen og / eller i mat konsentrasjon, eller på grunn av opphopning av utskillelse forbindelser i inkubasjonen vann 7,9 (og referanser deri). I tillegg til effekten av innesperring og modifiserte vanntilførsel, en større skjevhet av inkuberingsbetingelser teknikker som stammer fra re-filtreringseffekter (se for eksempel 10). Selv om noen av disse metodiske problemer er blitt overvunnet ved hjelp av riktig volum og form av inkubasjonen beholderen 11 eller med innføring av en resirkulerende klokkekrukke system in situ 12 denne teknikk undervurderer ofte fjerning og produksjonsrater. Kvantifisering metabolismen av oppløste forbindelser, slik som oppløst organisk nitrogen (DON) og karbon (DOC) eller uorganiske næringsstoffer, har vist seg å være spesielt utsatt for skjevheter som følge av ruge teknikker 13.
På slutten av 60-tallet og begynnelsen av 70-tallet, Henry Reiswig9,14,15 pioner bruk av direkte teknikker for å kvantifisere partikkel fjerning av gigantiske Caribbean svamper med separat prøvetaking vannet innånding og pustes ut av organismene i situ. På grunn av vanskeligheter med å anvende Reiswig teknikk på mindre fjæring matere og i mer utfordrende forholdene under vann, ble mesteparten av forskningen på dette feltet begrenset til laboratoriet (in vitro) ansette meste indirekte ruge teknikker 16. Yahel og kolleger ombygget Reiswig direkte in situ teknikken til å fungere i mindre skala forhold. Deres metode, betegnet Inex 16, er basert på samtidig undervanns prøvetaking av vann inhalert (I) og utåndet (Ex) ved uforstyrret organismer. Den forskjellig konsentrasjon av en substans (for eksempel bakterier) mellom et par av prøver (Inex) gir et mål for bibeholdelsen (eller produksjon) av det stoff av dyret. Inex teknikk syssels åpent rør oger avhengig av excurrent stråle produsert av pumpe aktiviteten av den undersøkte organisme til passivt å erstatte det omgivende vannet i oppsamlingsrøret. Mens Yahel og kolleger har med hell brukt denne teknikken i studiet av over 15 forskjellige suspensjon matere taxa (f.eks 17), er metoden begrenset av det høye nivået av praksis og erfaring som kreves, ved minuscule størrelsen på noen excurrent åpninger, og ved å sjøforhold.
For å overvinne disse hindringene, har vi utviklet en alternativ teknikk basert på kontrollert suge av samplet vann gjennom minute rør (utvendig diameter <1,6 mm). Vårt mål var å lage en enkel, pålitelig og rimelig enhet som ville tillate ren og kontrollert in situ vannprøver fra en svært bestemt punkt, for eksempel excurrent åpningen av bunnhenge matere. For å være effektive, har metoden for å være ikke-påtrengende for ikke å påvirke omgivelsene strømningsregime eller endre behavior av de undersøkte organismer. Enheten som presenteres her er betegnet VacuSIP. Det er en forenkling av den SIP-system utviklet av Yahel et al. (2007) 18 for ROV-basert point sampling i dyphavet. Den VacuSIP er vesentlig billigere enn den opprinnelige SIP og det er tilrettelagt for SCUBA basert arbeid. Systemet ble utviklet i henhold til prinsippene presentert og testet av Wright og Stephens (1978) 19 og Møhlenberg og Riisgård (1978) 20 for laboratoriet.
Selv om VacuSIP system er designet for in situ studier av metabolisme av bunnopphengsbrett, kan den også brukes for laboratoriestudier og hvor det kreves en kontrollert og ren, punkt-kilde vannprøve. Systemet er spesielt nyttig når integrasjon over lengre perioder (min-timer) eller in situ filtre er påkrevd. Den VacuSIP har vært brukt med hell på Yahel lab siden 2011, og har ogsåvært ansatt i to nyere studier av nærings flukser mediert av Karibien og Middelhavet svamp arter 21 (Morganti et al. innsendt).
Bruk av bestemte samplere, langvarig prøvetaking varighet, og feltforhold, der VacuSIP er anvendt, innebære noen avvik fra standard oseanografiske protokoller for innsamling, filtrering, og lagring av prøver for sensitive analytter. For å redusere risikoen for forurensning av den VacuSIP systemet og fare for modifikasjon av den samplede vann ved bakteriell aktivitet etter samling, testet vi forskjellige in situ filtrering og lagringsprosedyrer. Forskjellige filtrering enheter, samling fartøyer, og lagring av fremgangsmåter ble undersøkt for å oppnå den mest egnede teknikk for analyse av oppløst uorganisk (PO 4 3-, NO x -, NH4 +, SiO 4) og organisk (DOC + DON) forbindelser, og ultra-plankton (<1081; m) og partikkel organisk (POC + PON) prøvetaking. For ytterligere å redusere risikoen for forurensning, spesielt under feltforhold, ble antall håndteringstrinn reduseres til et minimum. Den visuelle format hvor fremgangsmåten er presentert er orientert for å lette reproduserbarhet, og for å redusere den tid som er nødvendig for effektivt å bruke teknikken.
Systemoversikt
For å prøve in situ pumpet vann fra suspensjons forer med exhalant åpninger så små som 2 mm, blir pumping aktivitet av hver prøve først visualisert ved å slippe ut filtrert fluorescein farget sjøvann ved siden av inhaleringsmiddel åpningen (e) og å observere dens strømning fra excurrent åpning 16 (se også figur 2B i 18). Vannet inhalert og pustes ut av studien prøven (incurrent og excurrent) blir deretter samtidig samplet ved anvendelse av et par med liten rør installert på spesialbygde manipulatoren eller på to av de "arms "av en opp-ned fleksibel bærbart stativ (figur 1 og Supplerende Video 1). Vannet inhaleres av studien organismen blir samlet ved forsiktig å posisjonere den proksimale ende av et rør inne i eller i nærheten av inhaleringsmiddel åpning av studien organisme. En identisk røret blir så plassert på innsiden av excurrent åpningen. Denne operasjonen krever god forsiktighet for å unngå kontakt eller forstyrrelse av dyret, for eksempel ved sediment resuspensjon. til å begynne samplings, skjærer en dykker en skillevegg i oppsamlingskaret med en sprøyte nål festet til distale ende av hvert rør, slik at det ytre vanntrykk for å tvinge det samplede vann inn i beholderen gjennom prøvetakingsrøret. suge~~POS=TRUNC er initiert ved hjelp av vakuum tidligere opprettet i ampullene og av trykkforskjellen mellom det ytre vann og det evakuerte prøvebeholderen .
For å sikre en ren samling av utåndet vann og for å unngå utilsiktet suging av ambient vann 16 må vannet samplingsfrekvens holdes på et betydelig lavere hastighet (<10%) enn excurrent strømningshastighet. Sugehastigheten styres ved lengden av røret, og dens indre diameter (ID). Den lille indre diameter sikrer også en ubetydelig dødt volum (<200 mL per meter rør). Prøvetaking over lengre perioder (minutter til timer) gjør det mulig å integrere den iboende patchiness av de fleste stoffer av interesse. For å sikre at prøvene er tilstrekkelig bevart i lange undervanns prøvetakinger så vel som for transport til laboratoriet, en in situ filtrering anbefales for følsomme analytter. Valg av prøvetakingsbeholdere, filtrering montering og rør er diktert av studie organismer og den spesifikke problemstillingen. Protokollen er beskrevet nedenfor går ut på at en fullstendig metabolsk profil er av interesse (for en oversikt se figur 2). Men den modulære naturen til protokollen kan feller enkel modifisering for å imøtekomme enklere eller til og med svært forskjellige prøvetakingsordninger. For fullstendig metabolsk profil, bør prøvetakingsprotokollen omfatter følgende trinn: (1) Flow visualisering; (2) Prøvetaking ultra-plankton fôring (plankton <10 mm); (3) Prøvetaking uorganiske næringsstoffer opptak og utskillelse (ved hjelp av in-line filter); (4) Prøvetaking oppløst organisk opptak og utskillelse (ved bruk av in-line filter); (5) partikler mating og utskillelse (ved bruk av in-line filter); (6) Gjenta trinn 2 (ultra-plankton fôring som kvalitetssjekk); (7) Flow visualisering.
Når logistisk mulig, anbefales det at den metabolske profilmålinger kombineres med pumpehastigheten (for eksempel fargestoffet fremre hastighet metode, i 16), så vel som med respirasjon målinger. Disse målingene er best tatt ved begynnelsen og slutten av prøvetagnings sesjon. For åndedrett måling, undervanns optodes eller mikroelektroder er å foretrekke.
forberedende skritt
Collector ampuller for DOM og næringsanalyse
Siden Samler fartøy kan interagere med oppløste mikrobestanddeler og sampler vegger kan være et substrat for bakterievekst 30-34, forskjellige ampuller for DOM og nærings samling ble testet. Borosilikat er ikke anbefalt for silika kvantifisering 33,35, siden glassflasker kan øke den opprinnelige konsentrasjonen av silika med opp …
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Manel Bolivar for hans hjelp i feltarbeidet. Vi er takknemlige til "Parc Natural del Montgrí, les Illes Medes jeg el Baix Ter" for deres støtte til våre forsknings- og prøvetaking tillatelser. Undervanns manipulator er designet av Ayelet Dadon-Pilosof og fabrikkert av Mr. Pilosof. Dette arbeidet ble støttet av den spanske regjeringen prosjektet CSI-Coral [stipend nummer CGL2013-43106-R til RC og MR] og av en FPU fellesskap fra «Ministerio de Educación, Cultura y Deporte (MECD)" til TM. Dette er et bidrag fra Marine Biogeokjemi og Global Change forskningsgruppe finansiert av den katalanske regjeringen [bevilgning antall 2014SGR1029] og ISF tilskuddet 1280-1213 og BSF tilskuddet 2.012.089 til G. Yahel.
GorillaPod, Original | Joby | GP000001 | flexible portable tripod |
Flangeless Ferrule | IDEX Health & Science | P-200X | 1/16" in Blue/pk |
Male Nut | IDEX Health & Science | P-205X | 1/16" in Green/10pk |
Female to Female Luer | IDEX Health & Science | P-658 | |
Female-Male Luer | IDEX Health & Science | P-655 | |
Peek Tubing (250µm ID) | IDEX Health & Science | 1531 | 1/16" OD x 0.01in ID x 5ft lenght. Alternative ID can be used |
Two component resin epoxy | IVEGOR | 9257 | Mix well the two component resin before use |
(TOC) EPA VIALS | Cole -Parmer | 03756-20 | 40 ml glass vials. Manifactured also by Thomas Scientific (ref. number 9711F09) |
HDPE VIALS | Wheaton | 986701 (E78620) | 20 ml high-density polyethylene vials |
Vacuette Z no additive | Greiner bio-one | 455001 | pre-vacuum by the manufacturer |
Septum Sample Bottles | Thomas Scientific | 1755C01 | 250 ml glass bottles |
Septum Cap 1 | Wheaton | W240844SP (E7865R) | 22-400 for HDPE vials |
Septum Cap 2 | Wheaton | W240846 (1078-5553) | 24-400 for glass vials and bottles. Also manufactured by Thermo Scientific National (ref. 03-377-42) |
In-line stainless steel Swinney Filter holders | Pall | 516-9067 | 13mm of diameter |
PTFE Seal Washer | Pall | 516-8064 | ring for stainless steel filter holders |
TCLP Glass Filters | Pall | 516-9126 | binder-free glass fiber filters, 13mm of diameter, pore size 0.7µm |
Polycarbonate Filter Holders | Cole -Parmer | 17295 | 13mm of diameter |
Isopore Membrane Filters | Millipore | GTTP01300 | 13mm of diameter, pore size 0.2 µm |
Contrad 2000 Solution | Decon Labs | E123FH | highly soluble basic mix of anionic and non-ionic surfactant solution |
Sterile Syringe Filters | VWR International Eurolab S.L. | 514-0061P | 25mm of diameter , pore size 0.2 µm |
Fluorescein | Sigma-Aldrich | (old ref.28802) 46955-100G | 100g |
Holdex, disposable,sterile | Greiner bio-one | 450263 | sterile, single-use tube holder with off-center luer for Vacuette |
Sterile Needles | IcoGammaPlus | 5160 | 0.7mm x 30mm |
Cryovials Nalgene | Nalgene | V5007(Cat. No.5000-0020) | 2ml |
Cryobox carton | Rubilabor | M-600 | 145x145x55mm p/microtube 1.5 ml |
Orthophosphoric Acid | Sigma | 79617 | |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | 500g |
Glutaraldehyde | Merck | 8,206,031,000 | 25%, 1 L |
Hand Vacuum Pump | Bürkle | 5620-2181 |