ここで我々が分離し、これらの組織から間葉系幹/間質細胞(MSC)の拡大が続く人間の満期胎盤から胎児と母体組織の切開のための方法を記載しています。
Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.
間葉系幹/間質細胞(MSC)は、細胞ベースの治療法1で使用するための有望な候補として浮上しています。ほとんどのアプリケーションは、MSC媒介組織修復または免疫調節2を標的とするように思われます。これらの用途の多くでは、同種異系MSCは自家MSC 3と同程度に有効であってもよいです。同種MSCの使用は、多くの患者を治療するための単一のソース組織4からの複数の細胞用量の大規模製造と適合性であるという経済的利点を有します。
歴史的には、前臨床および臨床研究は、MSC由来の骨髄4からを利用しています。骨髄は、一般的にボランティアドナーの腸骨稜から収集されます。このプロセスは、侵襲的であり、骨髄(〜20mL)中のわずかな量は、単一の穿刺を介して収集されます。 MSCの臨床的に意味のある数字を生成することは、 インビトロ拡大に広範囲が必要です。セルの効力は、通路の数とともに減少します<suP> 3、臨床的有効性のために必要な細胞の理論数は、より多くの細胞集団が展開されて増加するパラドックスを作成します。骨髄吸引とは対照的に、用語の胎盤は、ドナーに危険で帝王切開中に無菌的に採取することができる物理的に大きな始動組織(一般的に500〜750グラム4)、です。胎盤由来MSCは、骨髄由来MSCに優れた長期的な増殖5および免疫調節容量6を 、持っています。以前の研究では、単一の用語の胎盤は、最大7000の臨床用量4の製造のための十分なMSCが含まれていることを実証しました。これらの特性は、同種異系MSCの製造のための理想的な供給源組織プラセンタ作ります。
胎盤は、胎児と母親の両方の組織7からなる胎児母体臓器であり、したがって、胎児や母体の起源のMSCは、理論的には、分離することができます。以下の参考文献は、デを提供します開発と病理学上の尾情報、並びにヒト胎盤および付属器8,9の顕微鏡および肉眼検査。胎盤は、適切繁生絨毛膜(板)8で覆われた絨毛膜絨毛を構成する、主として胎児の血管および分泌と栄養膜と呼ばれる支持細胞から構成されています。分枝状の胎盤絨毛は栄養素、ホルモンと胎児と母親との間のガス交換を可能にする、子宮らせん動脈から配信母体血を浴びています。胎盤は、母体の脱落膜間質細胞を経由して子宮内膜に固定され、胎児extravillious栄養膜は、細胞外マトリックス8に散在しています。絨毛は、彼らが臍帯8を形成し 、胎児の絨毛膜板上に収束します。
胎盤由来幹細胞の最初の国際ワークショップ(2008年)の結果は、単離およびcharacterizatioを標準化する必要性の感謝でした人間の満期胎盤10からの細胞のn個。そのため、胎盤の解剖学の、異なる組織の切開は、MSCの単離および予想される培養の結果は、フィールドへの新規参入者のための圧倒的なことができます。このプロトコルでは、MSCの単離および拡大が続く胎盤絨毛組織の収穫は、徹底的に詳述されています。フローサイトメトリーを経由し、in vitro分化における MSCの特徴付けは、ルーチン5,11-13を考え、そのためだけに簡単にここで詳しく説明されています。
最近の系統的な文献レビュー14で強調したように、胎盤の絨毛から得られたMSCは、一般的に胎児であると仮定されています。 、研究のわずか18%が得られたMSCの起源を検討し、それらのが、研究の唯一の半分は、胎児MSCを報告し、他の半分は、母体または混合MSC集団を報告しました。本明細書中に説明した3つの組織成分のそれぞれ(絨毛、絨毛膜板及び基底脱落膜)がコンプです主に胎児膜/絨毛、および配信胎盤に付着したまま、子宮由来の母体細胞の小さな割合のosed。我々は以前に5,11を報告しているとして、母体MSCが望ましい場合ではなく、胎盤の胎児側より、胎盤の母側からMSCを単離し、より適切な出発物質であることを実証するデータを提供します。このプロトコルはまた、細胞培養への胎児や母体の貢献度を検証するXY FISHの使用を記載しています。これは、メーカーからの標準プロトコルであるが、この分析は、しばしば無視し、その重要性は、14を過小評価されています。
胎盤は、胎児または母体MSC 22を単離することができる物理的に大きく胎児母体器官です。ここで、我々は、胎盤の解剖学と命令具体的に脱落膜(母性)を解剖する方法については、絨毛膜絨毛(胎児)、および絨毛膜板(胎児)組織(ステップ2.2から2.4)の詳細な概要を提供します。その後、我々は、これら3つの組織(ステップ2.5から2.6)のそれぞれからMSCの分離を可能にする堅牢なプロトコルを概説しました。胎盤MSCの拡大は、効率的で、培養物は、骨髄由来MSCの培養( 図3と図 4)と同様に表示されます。脂肪細胞への分化が( 図5C)5一般的にはあまり効率的である一方で骨形成分化は、( 図5B)信頼性があります。
フィールドに多くの新規参入者は、胎児の絨毛膜絨毛または絨毛膜板組織由来の培養物は、胎児のMSCについて濃縮されるであろうと推定されます。しかし、我々の手中のFeタル細胞濃縮は、DMEM-LG + FBSを5利用されている10%のみと過渡時の標準的なMSC増殖培地です。ここでは、オスの赤ちゃん由来胎盤組織を使用して代表的な結果を提供します。母体細胞はXX染色体を有するものとして識別可能であるが、男性の赤ちゃんから胎盤組織を使用することにより、胎児細胞は、容易に識別可能XY染色体を持つようです。6は、代表的な文化のためのXY FISH結果を示しています。胎児のMSC(XY)は、胎児の絨毛膜絨毛または絨毛膜板組織由来の初期培養物で(80%まで)濃縮されているが、これらの同じ培養物を急速に最初の2つの通路の上に母性(XX)MSCによって(〜100%)に抜かれています。標準培地では、DMEM-LG + 10%FBS、胎児組織は、培養中の胎児由来の細胞を負かす汚染少数の母性由来MSCから構成される。
このプロトコルで概説重要なステップは、胎盤の解剖学的構造のどこ胎児から感謝ですそして、母体組織は、最も効果的に収穫することができます。代表的な結果のセクションで概説したように、胎児組織の切開は、胎児由来のMSCのための過渡的な濃縮を可能にします。拡大培地製剤の改善は、特定の外因性の成長因子培地の補充を介して胎児由来MSC集団の選択的拡大を可能にし、(私たちのグループは現在、このような培地製剤を開発している)胎児ではなく、母体細胞について濃縮された細胞生成物を製造する必要があります。胎児のMSCが等価母体MSC集団37より大きい血管形成および免疫抑制特性を有すると主張されているように、胎児のMSC集団の製造は、多くの利点を有することができます。
記載の分離プロトコルの各々において、我々は、組織の約10gを使用しました。全体の胎盤は、一般的に500〜750グラムで、前作で我々は、自動化された組織ダイジェストと細胞増殖バイオリアクターのprocを介してそれを実証しました単一の胎盤4から7,000以上の臨床細胞用量を製造することが可能でなければならないことesses。これらの数字は、同種異系MSC治療における胎盤由来MSCの潜在的な適合性、およびかかわらず(胎児や母体の)MSC由来のこの方法の重要性を強調表示します。治療の観点から、ユーザーが細胞産物と確実にこの細胞製品を製造する能力を完全に理解していることが最も重要です。私たちは、ビデオは、胎盤解剖学を理解胎盤からMSCを分離し、その文化の可能性が高い胎児や母体の細胞組成物を予測する研究者を支援することを願っています。
The authors have nothing to disclose.
RPは、国立保健医療研究評議会(NHMRC)ポストドクトラル研修フェローシップによってサポートされていました。 VSは、クイーンズランド大学国際大学院の学生の奨学金によってサポートされていました。 MRDはNHMRCとインナー・ホイールオーストラリアによってサポートされていました。
私たちは、患者の同意およびサンプル収集を支援するための臨床および看護スタッフに感謝します。私たちは産科、胎児胎盤の開発と胎盤の解剖学で洞察に満ちた議論のための教授ニコラス・フィスク、教授ケリー・アトキンソン博士ローハンラウリーに感謝します。
Reagents | |||
HBSS | Gibco/Invitrogen | 14185-052 | Long name: Hanks Balanced Salt Solution |
FBS | Gibco/Invitrogen | Long name: Fetal Bovine Serum | |
trypsin-substitute | Gibco/Invitrogen | 12563-029 | Long name: TrypLE Select |
DMEM-LG | Gibco/Invitrogen | 11885-092 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-Low Glucose |
DMEM-HG | Gibco/Invitrogen | 11965118 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L) |
PBS (Mg+Ca+ free) | Gibco/Invitrogen | 14190-250 | Long name: Dulbecco's Phosphate buffered saline, magnesium and calcium free |
Anti- anti- | Gibco/Invitrogen | 15240-062 | Long name: antibiotic-antimycotic solution x100 |
paraformaldehyde powder or 4% solution | any | ||
Collagenase I | Invitrogen | 17100-017 | 2500U/ml |
Dnase I | Sigma | D5025 | 10 mg/mL in 0.15 M NaCl |
Dispase | Invitrogen | 17105-041 | 10 mg/ml in water (20,000 U/ml). |
Material | Company | Catalog Number | Comments |
Disposables: | |||
50 ml centrifuge tubes | Falcon or any brand | ||
petri dishes, sterile plactic (25 cm and 10 cm diameter) | Nunc | ||
Cell strainers (100 micron) | Becton Dickinson | 352340 | |
175 and 75 cm2 (T175 and T75) tissue culture flasks | Nunc | ||
5 ml, 10 ml, 25 ml sterile serolgical pipettes | any brand | ||
Material | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment: | |||
Centrifuge | |||
tissue culture incubator 37 degrees celcius, 5 % CO2 | |||
Biological safety cabinet | |||
Sterile scissors and tweezers | |||
Tube racks | |||
Pipette-boy or equivalent | |||
Gilson type pipetters and sterile tips 1000 µl, 200 µl, 20 µl. | |||
rocking or shaking incubator (37 degrees celcius) | |||
personal protective equipment | |||
cleaning solutions (suitable for blood) | |||
waste containers, correct disposal bins for tissue/blood | |||
Reagents for MSC characterization | |||
Antibody (Clone ID) | Manufacturer | Catalogue No. | Isotype |
CD73 (AD2) | Miltenyi Biotec | 130-095-183 | Mouse IgG1 |
CD105 (43A4E1) | Miltenyi Biotec | 130-094-941 | Mouse IgG1 |
CD90/Thy-1 (AC122) | Miltenyi Biotec | 130-095-403 | Mouse IgG1 |
CD45 (5B1) | Miltenyi Biotec | 130-080-202 | Mouse IgG2a |
CD34 (AC136) | Miltenyi Biotec | 130-090-954 | Mouse IgG2a |
HLA-DR (AC122) | Miltenyi Biotec | 130-095-298 | Mouse IgG2a |
CD31 (PECAM-1) | BD Pharmingen | 555446 | Mouse IgG1 |
CD146 (541-10B2) | Miltenyi Biotec | 130-092-849 | Mouse IgG1 |
CD44 (DB105) | Miltenyi Biotec | 130-095-180 | Mouse IgG1 |
Isotype Controls (Clone ID) | Manufacturer | Catalogue No. | |
Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) | Miltenyi Biotec | 130-092-214 | |
Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) | Miltenyi Biotec | 130-092-212 | |
Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) | Miltenyi Biotec | 130-092-213 | |
Mouse IgG2a (S43.10) | Miltenyi Biotec | 130-091-837 | |
Mouse IgG2a (S43.10) | Miltenyi Biotec | 130-098-849 | |
MACS Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
Osteogenic differentation | Manufacturer | Catalogue No. | |
DMEM-HG | Gibco/Invitrogen | 11965118 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L) |
FBS | Gibco/Invitrogen | Long name: Fetal Bovine Serum | |
Anti- anti- | Gibco/Invitrogen | 15240-062 | Long name: antibiotic-antimycotic solution x100 |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
β-Glycerol Phophate | Sigma | 50020 | |
L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960-5G | |
Alizarin Red S | Sigma | A5533-25G | For calcium matrix staining |
Adipogenic differentation | Manufacturer | Catalogue No. | |
DMEM-HG | Gibco/Invitrogen | 11965118 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L) |
FBS | Gibco/Invitrogen | Long name: Fetal Bovine Serum | |
Anti- anti- | Gibco/Invitrogen | 15240-062 | Long name: antibiotic-antimycotic solution x100 |
insulin | Sigma | I2643 | |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
Indomethacin | Sigma | I7378 | |
3-isobutyl-1-methyl xanthine | Sigma | I5879 | |
Oil Red O solution | Sigma | O1391-250ML | For lipid vacuole staining |
XY FISH kit to determine fetal or maternal origin of cells | |||
XY chomosome FISH kit | Vysis (Abbott Molecular) | 07J20-050 | Long name: CEP X SpectrumOrange/Y SpectrumGreen Direct Labeled Fluorescent DNA Probe Kit |