从人胎盘组织源分离和间充质干扩张/基质细胞

昆士兰科技大学人类研究伦理委员会在母校卫生服务，皇家布里斯班妇女医院，和昆士兰大学认可的研究中使用的人胎盘样本的研究和收藏。所有协议符合国家研究的指导方针。患者提供了利用组织的以研究为目的知情同意书。 孕晚期胎盘是从下面，从在澳大利亚布里斯班上述医院足月例行剖腹产（CS）出生健康的母亲得到的。对于术语样品雄性不和谐怀孕在本研究中用于从母体细胞区分胎儿。胎儿性别已通过超声波产生和/或出生时由临床工作人员的新生儿的目视检查之前被确定。 原位杂交（FISH），X和Y染色体荧光用来进一步验证性别和胎儿或母体起源组织从保存原来胎盘。 1.收获前，准备以下注意：当进行了酶溶液，由制造商对每一个产品提供的具体要求和浓度应遵循。酶通常提供蛋白质的粗混合物，因此来自不同公司的类似的酶可能有不同的活动/浓度。由于这个原因，制造商的意见应该得到承认和解决方案的准备可能需要作相应修改。 制备或购买1.5到2升总无菌Hank氏平衡盐溶液（HBSS），用于该协议。 通过称出I型胶原酶制备胶原酶我原液和溶解为1mg / ml的HBSS和涡流轻轻以确保完全溶解。确定的HBSS（含有钙和镁）的使胶原酶溶液到100单位（U）/微升（1000倍原液），然后用0.2筛选所需的体积＃181，M注射器过滤。直到需要分装1毫升卷成1.5毫升管并储存在-20°C。 准备由无钙或镁的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS）以10毫克/毫升溶于非无菌分散酶分散酶原液。用DPBS进一步稀释没有钙或镁为2.4单位/毫升的最终浓度。过滤通过0.2μm的注射器过滤器进行消毒。直到需要1.5毫升管分装1毫升体积并储存在-20°C。 通过在0.15M NaCl的10毫克/毫升溶解的DNase-I制备脱氧核糖核酸酶（DNA酶）-I原液。 thorugh 0.2微米的注射器滤膜过滤。直到需要1.5毫升管分装1毫升体积并储存在-20°C。 通过组合100U / ml胶原酶类型制备工作的消化溶液I，I.5微克/毫升DNA酶I和2.4 U / ml的分散酶在无血清的DMEM中。新鲜解冻并稀释酶股在使用前立即。大约，1：消解液1的比例体积组织体积需要（ 如 10毫升组织的，在50ml管中测得的，需要10毫升消化溶液）。 制备在PBS中的4％多聚甲醛（PFA）中的溶液，并调节pH至7.4 15。商店25毫升分装，在-20℃下长期或在4℃下1周。 准备从补充有1×抗生素和抗真菌溶液和10％非热灭活的胎牛血清的DMEM低葡萄糖（DMEM-LG）的MSC培养基中。 MSC-级FBS可以从许多FBS的供应商购买。 高压灭菌器清扫设备提前按照机构准则。这些措施包括剪刀，镊子，解剖刀和一个大的金属夹层托盘。收集其他无菌组织培养塑料器具和消耗品（ 例如手术刀片50毫升和15毫升试管，将25ml，将10毫升和5ml移液管，和75或175 平方厘米细胞培养烧瓶）。 使用标准的原代细胞培养实验室设备：II b类适合初级细胞分离iosafety柜，细胞培养培养箱设定为5％的CO 2和37℃下，在37℃培养箱一个摇杆，并用50毫升管容量的离心机。 使用适当的个人防护装备：实验室外衣，2个副手套（在任何时候），安全防护眼镜，并靠近趾鞋按照机构准则。 事先准备的人的血液标本按机构的指导方针和液体生物废物容器适当净化解决方案。 2.胎盘MSC的分离羊胎素的制备穿着所需的个人防护装备。设置了所需的材料，解决方案和废物容器生物安全柜开展过程可达酶消化（第2.5.6）。 获得知情同意和伦理批准胎盘。通过收集剖宫产秒胎盘无菌手术条件下化，和包无菌袋或桶运送至实验室。 在运输过程中和之前夹层，在室温下储存或4℃胎盘。 注：组织可以在不影响细胞培养性能被存储长达6小时。 限制胎盘的收集和组织处理在可能的情况之间的时间。这一建议是基于实际问题。在一些情况下，我们已经延迟了出生后长达6小时的细胞分离过程。在这些情况下胎盘已被保持在室温或4℃（在实验室或在收集中心）。没有观察到可检测的差异，上述的一般供体变型中，从胎盘中获得的MSC时，被储存在4℃或室温。 放置在容器与在生物安全柜胎盘。打开容器和胎盘转移到一个无菌的托盘。 开出胎膜（羊膜或羊膜-绒毛膜绒毛的）8。成为与胎盘的部分定向。胎侧具有脐带插入，这是在一般情况下，在胎盘集中插入。产妇侧（与蜕膜内衬），这是相对的胎侧，具有明显的子叶（或裂片）。 开始剥离，定向与在无菌托盘朝上脐带胎盘。 注意：此协议被设计为产生足够的细胞接种到从每三个组织类型之一T175烧瓶中。每个摘要始于约10克组织的。这瓶从20ml的骨髓穿刺发起MSC文化的一个类似的起始编号。如果有更多的细胞是期望的，则更多的组织可以收获和协议可线性缩放。将收获的组织的大小仅仅是指示性的东西与胎盘组织实用。很少有definin克特征在胎盘绒毛，它可以作为一个参考点。指示的尺寸作为一个估计和脐带被用作胎表面上的一个里程碑。 蜕膜（四）组织的解剖翻转胎盘过来，让母体面（底蜕膜）朝上。确保胎侧脐带插入点朝下。 从胎盘（含底蜕膜组织）的母亲一边切割厚0.5cm的片。 将在解剖组织块放入含有HBSS培养皿中，以保持水分的组织块。 转移足够的组织填充管到10毫升标记在50ml管（这大约为10克组织的）。 绒毛膜板夹层（CP）组织机械移除胎盘（不羊膜囊​​）的胎儿面的羊膜，留下町叶状rionic（绒毛膜板）不变。 0.5厘米的绒毛膜板深裁片〜1厘米宽。收获来自该地区的绒毛膜板最近的脐带，从胎盘的边缘了。 将组织块放入夹层中含有HBSS的培养皿，以保持他们水合。 转移足够的组织填补50ml管到10 ml刻度线（〜10克组织的）。 绒毛的夹层（CV）组织解剖CV组织约1厘米2×0.5-1厘米从哪里CP已被移除胎盘组织深。再次，从最接近脐带的区域，从胎盘的边缘离收获的简历。尝试从胎盘母体的身边至少有1厘米的距离（含底蜕膜组织）;我们的目标是从胎盘绒毛组织的内部收获组织。 将组织块放入狄氏过程中含HBSS培养皿ction让他们水合。 转移足够的组织填补50ml管到10 ml刻度线（〜10克组织的）。 切碎和D，CP的酶消化，和CV胎盘组织由于有10〜克D-中，CP或CV组织在三个不同的50ml试管，填充每个管加入约40ml的HBSS，并多次反转管，以洗组织（重复〜10秒）。 倒出上清液，并重复此洗涤步骤2-3次，直到溶液是从血液中基本上没有。用10毫升吸管或长镊子以确保倾析上清液，当组织片不会丢失出管（多个）。 返回组织块到10cm的培养皿中以最小的液体传输。印章/剁碎组织成细片约1-5毫米的3剪刀或刀片。 转移剁碎组织放回适当标记（D，CP或CV）50ml试管。 添加新鲜prepar编消化介质中的至少一个1：1的比例与组织（ 例如 10毫升组织加10毫升消化介质的）。替换每个管盖并倒转试管几次以混合。 孵育组织与在37℃下消化介质1-2小时的管中。湿润气氛和5％CO 2的不需要的这一步。 注意：快速振荡，需要以有效地分离来自组织的细胞和最大化MSC产量。通过在48小时和一个第一通过时间超过1-2周更长附着在培养瓶非常少数细胞有限产量将是显而易见的。温育时间和摇动法是依赖于37℃培养箱，可以在实验室和可能需要优化。 对于具有快速和可控制的摇动机构，地点组织培养箱并消化在培养箱50ml管或无菌锥形瓶中，地点中，设置振荡速度至​​250rpm。这将导致在一个完整的摘要所述组织在1小时。 可替代地，对于具有温和的摇摆或无摆动机构的恒温箱，手动迅速并剧烈摇动该管通过手10秒为1.5至2小时，每30分钟。这种酶的潜伏期是一个合适的时间丢弃垃圾，清除不必要的项目的生物安全柜，改变实验室的外衣弄脏和程序的下一个部分做准备。 单个核细胞采集和电镀成瓶注意：从前面的步骤中，有三个50ml试管（D，CP或CV）与消化组织片。当组织消化溶液演变混浊外观和白色的血管组织中是显而易见的，消化完全。 30ml含有胎牛血清的MSC介质添加到每个管灭活包含在消化溶液中的酶。 到了单核细胞从大未消化的碎片分开，脉冲离心50毫升管。简单地说，允许离心机达到为340 x 克5秒，然后停止。这将迫使大碎片在试管的底部沉淀，同时使单核细胞中的液体悬浮液。 注意：单核细胞将保持在液相如果管是只简单地（脉冲）离心。如果离心延伸时，单核细胞也将沉淀在与组织片在管的底部，从而导致不​​希望的细胞的损失。 收集上清液，将含有单核细胞，并用移液管转移到一个新的50ml管中此。 加入30ml媒体或HBSS加入剩余的胎盘组织碎片，剧烈摇动。这将使剩余分离单个核细胞悬液成，使从组织公认的MSC的第二个收获。 脉冲离心管中的第二次，并再次将上清液转移至新的50ml管中。重复此步骤的第三时间，最大限度地收集效率从每个组织来源的单核细胞。 汇集来自每个个体的组织类型的上清液分为两50ml试管。这将产生6管总（2管每个D，CP和简历）。离心每个管在340×g下5分钟。此步骤将沉淀的单核细胞到管的底部。 小心倒出或移液器关闭上清到浪费。这是不必要的尝试，以消除上清液每一滴。 注意：将细胞沉淀将脆弱由于大量红细胞。要小心，不要意外弃沉淀，如果你是直接从50毫升管调迁。 除去大部分上清液后，轻轻几次用手指轻弹管撞出细胞沉淀。结合颗粒，使得存在用于每个D，CP或CV组织单管和在35毫升的MSC介质的悬浮每个。 可选：通过100微米网状细胞滤网过滤的单核组分集U中的p 50ml管以除去细胞团块或纤维材料。 注意：作为过滤器可以很容易地堵塞和过度填充护理是必需的。此外，气泡可以从引流阻塞过滤器。如果发生这种情况，慢慢提起过滤出管的以允许空气在过滤器下通过与细胞培养基或交换流动，洗净过滤到一个新的过滤器。不包括滤波步骤似乎不改变在随后的MSC培养物的产率或质量。 任选地，红血细胞（RBC）裂解或密度梯度离心可在此阶段15进行。然而，我们的经验是，红细胞不与MSC附着或增殖，因此RBC裂解干扰是没有必要的。单核细胞可以在这一步，如果去除红细胞进行15计算。虽然，在这个阶段，绝大多数细胞不会MSC，但是胎儿起源滋养层，内皮细胞和造血细胞，以及马ternal起源造血细胞及蜕膜基质细胞。 在37℃下转移为每个D，CP或CV组织的细胞悬浮液到一个单一的T175烧瓶中，并培养在湿润的培养箱中和5％的CO 2。 交分离细胞膨胀在48小时之后的初始隔离，从每个烧瓶（D，CP和CV）的除去培养基并用35ml新鲜的MSC介质的替换。用过的培养基和分离的细胞可以被丢弃，因为推定的MSC被假定为连接于组织培养瓶16。返回烧瓶培养箱另外24小时。 以下培养另外24小时后，用DPBS（25毫升）洗烧瓶两次，以除去碎屑和红细胞。漩涡围绕烧瓶撞出红细胞底部的液体。使用移液管除去的液体和碎屑。添加35毫升的MSC介质向瓶和烧瓶返回到培养箱中。 更换介质每周两次，并在cubate培养直至单层细胞是80-90％汇合。此初始扩张需4-14天，取决于组织的质​​量，原料和效率，孵育时间与消化溶液的量。 3.私营军保公司的亚文化当文化是80-90％融合，用20毫升1X HBSS或DPBS洗两次，并丢弃洗。胰蛋白酶替代添加到每个烧瓶中（ 即使用5号毫升一T175瓶）。 孵育5分钟的烧瓶在37℃以从组织培养表面解放的MSC。挖掘烧瓶的侧面每〜2分钟，以促进分离。 当细胞从表面和在一个单一的细胞悬浮液分离，从MSC介质烧瓶洗细胞并收集细胞在试管中。海安媒体将淡化和取消胰蛋白酶替代品（使用每〜T175瓶15毫升MSC媒体）。 转移的每个组织培养瓶的内容传送到一个​​50ml管。 在340×g离心5分钟离心管以沉淀细胞。 弃去上清液并在1毫升的MSC介质的重悬细胞沉淀。 稀释10微升细胞悬浮于10μl台盼蓝。算使用血球细胞和计算单元15的总数。 转移细胞到新的培养瓶中在1150细胞/ cm 2新鲜的MSC介质和在组织培养箱孵育。在此接种密度，种子200000 MSC到在35毫升的MSC介质的每一个新的T175烧瓶中。饲料细胞每周两次，直到80-90％汇合。在1150细胞/ cm 2或200000的MSC到每个T175烧瓶种子后续的传代。 当通道1（P1）或P2细胞汇合，冷冻保存的大部分细胞以供将来使用，并且补种只有一个进一步繁殖和表征T175烧瓶中。所传播的细胞可以在P3或P4用于经由FL中胚层分化测定和细胞表征流式细胞仪。 注意：在早期传代，可以存在很少疏分离菌落，但每一集落内的局部细胞密度可以非常高。这是不理想的，因为细胞的局部致密填料会导致接触抑制，延缓生长和减少培养性能。我们建议当密菌落观察到的，细胞应收获再接种到新的烧瓶中。这个再分配方法提供细胞室增殖，并整体培养性能将得到改善。 冻存的MSC，收集〜1×10 6个细胞在1ml 90％FCS和10％的二甲亚砜（DMSO）中，并使用标准方案冻结。 注意：在代表性的结果部分中，有使用流式细胞仪MSC表征，中胚层分化和XY FISH分析的描述，以确定三种不同的（D，CP和CV）扩增的细胞群的性别。在我们的研究中，胎盘分别来自男宝宝;因此，所有的胎儿细胞可以区分为男性（Y染色体）和所有母亲的细胞可以（只有X染色体）来区分的女性。