בזאת אנו מתארים שיטות לנתיחה של רקמות יולדות ועובר מן שלית מונח אנושית, ואחריו בידוד והרחבת גזע mesenchymal / בתאי סטרומה (MSC) מרקמות אלה.
Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.
גזע mesenchymal / בתאי סטרומה (MSC) הם מתעוררים כמועמד מבטיח לשימוש טיפולים מבוססי תאים 1. רוב היישומים נראה כי הן מיועדות לתקן רקמות MSC בתיווך או תקנה החיסונית 2. בשנת רבים של יישומים אלה, אלוגנאית MSC יכול להיות יעיל כמו עצמיים MSC 3. השימוש MSC אלוגנאית יש את היתרון הכלכלי של להיות תואם עם ייצור בקנה מידה גדול של מנות תאים מרובים ממקור יחיד רקמות 4 לטפל בחולים רבים.
מבחינה הסטורית, פרה-קליניים ומחקרים קליניים מנוצלים MSC-נגזר מח העצם 4. מוח העצם נאסף בדרך כלל מפסגת הכסל של תורם מתנדב. תהליך זה הוא פולשני, ורק נפח קטן של מח (~ 20 מ"ל) נאסף באמצעות ניקור יחיד. יצירת מספרים בעלי משמעות קלינית של MSC דורש נרחב הרחבה חוץ גופית. עצמה ניידת יורדת עם מספר מעבר <sup> 3, יצירת פרדוקס שבו המספר התיאורטי של תאי דרושי יעילות קלינית הוא גדל יותר אוכלוסיית התאים מורחבת. בניגוד aspirates מח עצם, שלית הטווח היא רקמת מוצא גדולה פיזי (בדרך כלל 500-750 גר '4), אשר ניתן לקצור בסביבה נקיה מחיידקים במהלך ניתוח קיסרי ללא סיכון לתורם. יש MSC נגזר שליה לטווח ארוך התפשטות 5 ו אימונו-קיבולת 6, תנעל MSC מח נגזרות עצם. במחקר קודם, הראינו כי שליה מונחת בודדת כלולה MSC מספיק לייצור של עד 7,000 מנות קליניות 4. תכונות אלו הופכות את שלית רקמת מקור אידיאלית לייצור MSC אלוגנאית.
השליה היא איבר fetomaternal מורכב משני הרקמות יולדות ועובר 7, ובכך MSC ממוצא עוברי או אימהי יכול להיות, באופן תיאורטי, מבודד. האזכורים הבאים מספקים דהמידע זנב על התפתחות ופתולוגיה, כמו גם בדיקה מיקרוסקופית ואת מקרוסקופית של השליה האנושית adnexa 8,9. השליה נכונה מורכבת בעיקר של כלי הדם של העובר ואת הפרשה ותאים תומכים בשם trophoblasts, מה שהופך את villi כוריוני מכוסה סיסית frondosum (צלחת) 8. Villi השליה מסועף שטופים בדם האם נמסר מן העורקים ספירלה הרחם, מה שמאפשר מזין, הורמון חילוף הגזים בין העובר לאם. השליה מעוגנת האנדומטריום באמצעות תאי סטרומה decidual אימהיים trophoblasts extravillious העוברי משובצים ב מטריקס 8. Villi להתכנס לצלחת כוריוני העובר שם הם יוצרים את חבל הטבור 8.
פועל יוצא של הסדנה הבינלאומית הראשונה על תאי גזע שמקורם השליה (2008) נרשם ייסוף של צורך לתקנן את הבידוד characterization של התאים מפני השליה מונח אנושי 10. בגלל האנטומיה של השליה, דיסקציה של הרקמות השונות, בידוד של MSC ותוצאות התרבות הצפויה יכולים להיות מכריעים עבור עולים חדשים בתחום. בפרוטוקול זה, הקציר של רקמות שליה שליה, ואחריו בידוד MSC והרחבת הוא מפורט היטב. אפיון MSC באמצעות זרימת cytometry וב בידול במבחנה נחשב שגרת 5,11-13, ובכך רק בקצרה מפורט כאן.
מודגש כמו סקירת ספרות שיטתית אחרונה 14, MSC המתקבל villi כוריוני השליה הם הניחו בדרך כלל להיות עובריים. אמנם, רק 18% מהמחקרים בחנו את מקורו של MSC שהושג, ושל אלה, רק חצי מהמחקרים דיווחו MSC העובר ואת החצי השני דיווח אוכלוסיות MSC אימהיות או מעורבות. כל אחד שלושת המרכיבים רקמות כפי שיתואר בהמשך (villi כוריוני, basalis צלחת decidua כוריוני) הם composed בעיקר של קרום / villi העובר, וחלק קטן של תאים אימהיים הנגזרות הרחם, אשר נשארים מחוברים השליה נמסר. אנו מספקים נתונים הוכחת כי לבודד MSC מהצד האימהי של השליה, ולא בצד העוברי של השליה, כפי שכבר דווחו בעבר 5,11, הוא חומר מוצא מתאים יותר אם MSC האימהי הם רצויים. פרוטוקול זה גם מתאר את השימוש FISH XY כדי לאמת תרומה עוברית או אימהית בתרביות תאים. אמנם זה פרוטוקול סטנדרטי מהיצרן, ניתוח זה הוא מוזנח לעתים קרובות וחשיבותו לזלזל 14.
השליה היא איבר fetomaternal גדול פיזית, שממנו MSC עוברית או אימהית ניתן לבודד 22. בזאת, אנו ספקנו סקירה מפורטת של האנטומיה שליה והדרכה על איך לנתח במיוחד decidua (מצד אמו), chorionic villi (עובר), צלחת כוריוני (עובר) רקמה (שלב 2.2-2.4). בהמשך לכך, אנו התווינו פרוטוקול חזק המאפשר בידוד MSC מכל אחד משלוש רקמות אלה (שלב 2.5-2.6). הרחבת השליה MSC יעילה ותרבויות להופיע דומות תרבויות MSC עצם שמקורם במח (איורים 3 ו -4). בידול osteogenic הוא אמין (איור 5), בעוד בידול adipogenic הוא פחות יעיל בדרך כלל (איור 5 ג) 5.
עולים חדשים רבים לשדה יהיה להניח כי תרבויות נגזר villi כוריוני עוברית או רקמות צלחת כוריוני יהיה מועשר עבור העובר MSC. עם זאת, בידינו Feעשרת תא טל הוא רק חולפים כאשר בינוני הרחבת MSC סטנדרטי כגון DMEM-LG + 10% FBS מנוצל 5. כאן אנו מספקים תוצאות נציג באמצעות רקמות השליה נגזרו תינוק זכר. באמצעות רקמת השליה מתינוק זכר, בהתנהגותם של התאים העובריים הם בקלות המאפשר לזהותו כבעל הכרומוזומים XY, בעוד תאים אימהיים ניתנים לזיהוי כבעל כרומוזומים XX. איור 6 מציג תוצאות FISH XY לתרבות נציג. בעוד MSC העוברית (XY) מועשרת (עד 80%) בתרבויות הראשוניות נגזרות villi כוריוני עוברי או רקמות צלחת כוריוני, התרבויות אותן הם עקפו במהירות (~ 100%) על ידי אימהי (XX) MSC בשנתי הקטעים הראשונים . במדיום סטנדרטי, מורכב DMEM-LG + 10% FBS, המעטים MSC אימהי הנגזרות כי לזהם את רקמות העובר outcompete התאים שמקורם בעובר בתרבות.
שלב קריטי המפורטים בפרוטוקול זה הוא הערכה של האנטומיה השליה ומאיפה עובריתורקמות אימהיות ניתן לקצור בצורה היעילה ביותר. כפי שתואר בסעיף תוצאות נציג, דיסקציה של רקמה עוברית אין לאפשר העשרה חולף עבור MSC הנגזרות עוברית. שיפורים בניסוח בינוני רחבה, באמצעות תוספת בינוני פקטור גדילה מסוימת אקסוגניים אמורים לאפשר רחבה סלקטיבית של האוכלוסיות העובריות נגזרות MSC, ולייצר מוצר תא כי הוא מועשר עבור עובר ולא תא אימהי (הקבוצה שלנו בפיתוח פורמולציות בינוניות כאלה כרגע). הייצור של אוכלוסיות MSC עובריות עשוי להיות מספר היתרונות, כפי MSC העובר הם התיימרו להיות אנגיוגנזה יותר ומאפייני אימונוסופרסיבי מאשר אוכלוסיות MSC אימהיות שווות 37.
בכל אחד מהפרוטוקולים בידוד תיאר, השתמשנו כ 10 גרם של רקמת גוף. שליה שלמה היא בדרך כלל 500-750 גר ', ו בעבודה קודמת הראינו כי דרך רקמות אוטומטיות לעכל וכן proc bioreactor הרחבת תאesses כי זה צריך להיות אפשרי כדי לייצר יותר מ -7,000 מנות תא קליניות מ יחיד השליה 4. מספרים אלה מדגישים את התאמותיו פוטנציאל של MSC נגזרת שלית טיפולי MSC אלוגנאית, ואת המשמעות של שיטה זו שאינה מותנית במוצא MSC (עוברי או אימהי). מנקודת מבט טיפולי, חשוב ביותר שלמשתמשים הבנה מלאה של מוצר התא ואת היכולת מהימנה מייצרת מוצר תא זה. אנו מקווים כי הווידאו שלנו יסייע לחוקרים להבין האנטומיה שליה, לבודד MSC מן השליה, ולצפות את הרכב של התא עוברי או אימהי הסביר של תרבותם.
The authors have nothing to disclose.
RP נתמכה על ידי המועצה הלאומית למחקר בריאות ורפואה (NHMRC) אחוות עבודת הפוסט דוקטורט. VS נתמכה על ידי מלגה לסטודנטים לתארים מתקדמים הבינלאומי של אוניברסיטת קווינסלנד. MRD נתמכה על ידי NHMRC והפנימית גלגל אוסטרליה.
אנו מודים צוות קליני וסיעוד לסיוע בהסכמה חולה אוסף מדגם. אנו מודים פרופ 'לניקולאס פיסק, פרופ' קרי אטקינסון וד"ר רוהאן לוריא לדיונים תובנה במיילדות, פיתוח feto-שליה ואנטומיה השליה.
Reagents | |||
HBSS | Gibco/Invitrogen | 14185-052 | Long name: Hanks Balanced Salt Solution |
FBS | Gibco/Invitrogen | Long name: Fetal Bovine Serum | |
trypsin-substitute | Gibco/Invitrogen | 12563-029 | Long name: TrypLE Select |
DMEM-LG | Gibco/Invitrogen | 11885-092 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-Low Glucose |
DMEM-HG | Gibco/Invitrogen | 11965118 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L) |
PBS (Mg+Ca+ free) | Gibco/Invitrogen | 14190-250 | Long name: Dulbecco's Phosphate buffered saline, magnesium and calcium free |
Anti- anti- | Gibco/Invitrogen | 15240-062 | Long name: antibiotic-antimycotic solution x100 |
paraformaldehyde powder or 4% solution | any | ||
Collagenase I | Invitrogen | 17100-017 | 2500U/ml |
Dnase I | Sigma | D5025 | 10 mg/mL in 0.15 M NaCl |
Dispase | Invitrogen | 17105-041 | 10 mg/ml in water (20,000 U/ml). |
Material | Company | Catalog Number | Comments |
Disposables: | |||
50 ml centrifuge tubes | Falcon or any brand | ||
petri dishes, sterile plactic (25 cm and 10 cm diameter) | Nunc | ||
Cell strainers (100 micron) | Becton Dickinson | 352340 | |
175 and 75 cm2 (T175 and T75) tissue culture flasks | Nunc | ||
5 ml, 10 ml, 25 ml sterile serolgical pipettes | any brand | ||
Material | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment: | |||
Centrifuge | |||
tissue culture incubator 37 degrees celcius, 5 % CO2 | |||
Biological safety cabinet | |||
Sterile scissors and tweezers | |||
Tube racks | |||
Pipette-boy or equivalent | |||
Gilson type pipetters and sterile tips 1000 µl, 200 µl, 20 µl. | |||
rocking or shaking incubator (37 degrees celcius) | |||
personal protective equipment | |||
cleaning solutions (suitable for blood) | |||
waste containers, correct disposal bins for tissue/blood | |||
Reagents for MSC characterization | |||
Antibody (Clone ID) | Manufacturer | Catalogue No. | Isotype |
CD73 (AD2) | Miltenyi Biotec | 130-095-183 | Mouse IgG1 |
CD105 (43A4E1) | Miltenyi Biotec | 130-094-941 | Mouse IgG1 |
CD90/Thy-1 (AC122) | Miltenyi Biotec | 130-095-403 | Mouse IgG1 |
CD45 (5B1) | Miltenyi Biotec | 130-080-202 | Mouse IgG2a |
CD34 (AC136) | Miltenyi Biotec | 130-090-954 | Mouse IgG2a |
HLA-DR (AC122) | Miltenyi Biotec | 130-095-298 | Mouse IgG2a |
CD31 (PECAM-1) | BD Pharmingen | 555446 | Mouse IgG1 |
CD146 (541-10B2) | Miltenyi Biotec | 130-092-849 | Mouse IgG1 |
CD44 (DB105) | Miltenyi Biotec | 130-095-180 | Mouse IgG1 |
Isotype Controls (Clone ID) | Manufacturer | Catalogue No. | |
Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) | Miltenyi Biotec | 130-092-214 | |
Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) | Miltenyi Biotec | 130-092-212 | |
Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5) | Miltenyi Biotec | 130-092-213 | |
Mouse IgG2a (S43.10) | Miltenyi Biotec | 130-091-837 | |
Mouse IgG2a (S43.10) | Miltenyi Biotec | 130-098-849 | |
MACS Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
Osteogenic differentation | Manufacturer | Catalogue No. | |
DMEM-HG | Gibco/Invitrogen | 11965118 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L) |
FBS | Gibco/Invitrogen | Long name: Fetal Bovine Serum | |
Anti- anti- | Gibco/Invitrogen | 15240-062 | Long name: antibiotic-antimycotic solution x100 |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
β-Glycerol Phophate | Sigma | 50020 | |
L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960-5G | |
Alizarin Red S | Sigma | A5533-25G | For calcium matrix staining |
Adipogenic differentation | Manufacturer | Catalogue No. | |
DMEM-HG | Gibco/Invitrogen | 11965118 | Long name: Dulbecco’s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L) |
FBS | Gibco/Invitrogen | Long name: Fetal Bovine Serum | |
Anti- anti- | Gibco/Invitrogen | 15240-062 | Long name: antibiotic-antimycotic solution x100 |
insulin | Sigma | I2643 | |
Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
Indomethacin | Sigma | I7378 | |
3-isobutyl-1-methyl xanthine | Sigma | I5879 | |
Oil Red O solution | Sigma | O1391-250ML | For lipid vacuole staining |
XY FISH kit to determine fetal or maternal origin of cells | |||
XY chomosome FISH kit | Vysis (Abbott Molecular) | 07J20-050 | Long name: CEP X SpectrumOrange/Y SpectrumGreen Direct Labeled Fluorescent DNA Probe Kit |