Summary

T Lenfosit-Yapışma Molekülü Etkileşimleri Çalışmaları Yapışma Altında Kesme Stres Testi

Published: June 29, 2016
doi:

Summary

Bu akış yapışma deneyi T hücresi epitel hücre etkileşimleri basit, çok etkili bir model sağlar. Bir şırınga pompası kayma gerilimi oluşturmak için kullanılır ve konfokal mikroskopi ölçümü için görüntü yakalar. Bu çalışmaların amacı, etkili akış koşulları kullanılarak T hücre yapışmasını ölçümüdür.

Abstract

Genel olarak, T hücresi yapışma immünolojik sinaps oluşumunda antijen sunan hücreler (APC) ile birlikte enflamasyon ve etkileşim bölgelerine hücresel alımının has süreçlere katkıda işlev kritik bir unsurdur. T hücresi kan daman etkileşimleri dolaşımı kendisi tarafından üretilen kesme stresi tarafından meydan ise T hücresi yapışma bu iki bağlama, hücre APC etkileşimlerinin statik olarak kabul edilebilir T farklıdır. T hücresi-APC etkileşimlerinin iki hücre ortağı birbirine statik olarak olduğu statik olarak sınıflandırılır. Genellikle, bu etkileşim, lenf düğümleri içinde meydana gelir. Bir T hücresi kan damarı duvarı ile etkileşime gibi, hücreler tutuklama ve üretilen kayma gerilmesi dayanıklı olmalıdır. 1,2 Bu farklılıklar daha iyi iki ayrı düzenleme süreçleri gibi akış koşulları altında statik yapışma ve yapışma anlama ihtiyacını vurgulamaktadır. T hücre yapışmasının düzenlenmesi en özlü con olarak tanımlanabilirhücre yüzeyi üzerinde tanımlı molekülleri integrin ve böylece etkileşim hücrenin yüzeyi üzerinde ifade edilen yapışma molekülü ligandlarla İntegrinlerin etkileşimleri düzenleyen afinitesi durumunu sırtı. Integrin afinite devletlerin düzenleme bizim mevcut anlayış vitro model sistemlerde genellikle basit geliyor. adezyon burada açıklanan akış koşulları kullanılarak tahlil görselleştirme ve bir uyarıcı, aşağıdaki gerçek zamanlı olarak T hücresi epitel hücre etkileşimleri hassas ölçümü sağlar. akış deneyinde küçük bir yapışma önleyici veya uyarıcı maddeler ile tedaviden sonra T hücreleri içinde yer alan sinyal yapışma çalışmalara uygulanabilir. Buna ek olarak, bu deney, bir yapıştırıcı lökosit nüfus ve bir integrin yapışma molekülü çifti, T hücresi sinyal dışına taşabilir.

Introduction

T lemfosit yapışması T hücresi trafiği ve antijen sunumu üzerinde kritik bir rol oynayan 3, sağlıklı bir bağışıklık sisteminin belirgin süreçlerin bir dizi aracılık eder. Immün gözetim veya yapışma için, bu iki geniş roller kritik aktif bir bağışıklık tepkisi sırasında belirtir. 4. T hücresi-endotelyal hücre etkileşimleri fizyolojik sinyal olayları (APC) etkileşimlerinin sergileyen hücre T hücre-antijen farklıdır ve bu nedenle ayrı işlemler gerektiren çalışma en iyi yer sinyalizasyon kaskadlar anlamak için. lenfosit ekstravazasyon sırasında kan damarı çeperi bir T hücresinin Sıkı yapışma, hızlı ve dinamik integrin aktivasyonunu gerektirir. Endotel boyunca aktif bir devlet integrin ve yapışma molekülleri arasındaki sıkı etkileşim T hücreleri hücre geçit keyfi bir alanda arama yüzeyi boyunca tarama sağlayan, kan akışına dayanıklı yapışma yol açar. 5 T hücresi bi taramasını -directionally alonga damar duvarı T hücresinin bir tat yapışkan ön ucu, polarize yapışma bağımlı olduğunu. 6. En önemlisi, sıkıca yapışmasını ve göç kan akımı dolaşan tarafından üretilen kesme kuvvetine direnç gerektirir.

lenfosit yapışma incelemek için deneyler tasarlarken, dikkat ilgi belirli uyarana dikkat edilmelidir. aktivasyonu integrin T hücresi yapışma tüm biçimlerinin yaygın ve ciddi bir komponent ise, aktivasyon kaskadları tek tek reseptör ve ko-reseptörlerin aşağı benzersiz olması muhtemeldir. Aynı şekilde, integrin ve adezyon molekül çiftleri uzman mikroçevrelerde ve belirli alt popülasyonlar üzerinde çalışır. Bu şekilde, bu çiftleri oldukça farklı düzenlenmiş olabilir. Burada sunulan model, makaslama stres koşulları altında yer alan aktivasyon integrin giden sinyal basamaklarının çalışma için idealdir. 7 Bu etkileşimler yeterince statik adhesi içinde anlaşılamazsistemde bağlı etkisi, bu kuvvetler 8 rağmen., T hücresi davranışına doğrudan sahip olduğu gösterilmiş olan insan ICAM-1 (CHO-ICAM hücreleri) ifade etmek üzere geliştirilen T hücreleri ve CHO (Çin hamster yumurtalık) hücreleri sistemi olabilir, burada sunulan kolayca lökosit popülasyonları veya adezyon molekülleri farklı çalışma için modifiye edilebilir.

Bu deney, lökosit ekstravazasyonu Sıkı yapışma aşaması için bir model sağlayarak, kesme zoru stresi ile T hücresi yapışma ve integrin aktivasyonunu ölçmek için bir yöntem sağlar. CHO-ICAM hücreler kullanılarak canlı hücrelerde ligandının LFA-1 afinitesi ilgi çeşitli stimulasyona tepki olarak bir gerçek zamanlı olarak incelenebilir. Bu teknik, kolay büyük ölçüde diğer modellere kıyasla kan akışını ve kesme stresi modellemek için gerekli ekipman basitleştirilmesi, bir şırınga pompası ile kombinasyon halinde ticari olarak temin edilebilen mikro-akış odaları elde gerektirir. 9 Bu testin bir başka önemli avantajı, belirli bir sinyal olduğucascades ve bireysel integrinlerin elde edilen aktivasyon durumu temiz bir ilgi insan adezyon moleküllerini eksprese eden işlenmiş CHO hücrelerinin kullanımı yoluyla incelenebilir. Buna ek olarak, canlı hücre görüntüleme ile nicel veriler kombinasyonu, bu yöntemin önemli bir avantajıdır. Statik T hücre yapışmasının bir çok deney güzel T hücresi-APC etkileşimlerinin model, tarif edilmiş olmasına rağmen, genel olarak, bu modeller, T hücresi-epitelial yapışma dinamik yakalama işlemini yetersizdir. bir yapışma deneyi seçerken Bu nedenle, söz konusu uyaran düşünülmelidir.

Protocol

1. Kaplama CHO-ICAM Hücreleri Not: Bu adımın amacı konfluent tek tabaka üretme hedefi ile gece boyunca büyümeleri için akış gözlerinden CHO-ICAM hücreleri plaka etmektir. % 5 ile 37 ° C'de% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin (CHO-ICAM tam kültür ortamı) ile desteklenmiş 10 mi RPMI ortamında 10 cm doku kültürü tedavi kültür tabaklarında CHO-ICAM hücreleri korumak CO 2. hücreleri toplamak için, 1 ml% 0.5 tripsin-EDTA ekleyin …

Representative Results

Gösterildiği gibi Örnek sonuçlar SDF-1α ile uyarılmış, Jurkat ve primer insan CD3 + T hücreleri kullanılarak akış yapışma tahlilinden gösterilmektedir. Tüm gösterilen deneylerde negatif kontrol uyarılmamış hücrelerdir. uyarılmamış hücrelerde bir eşik bazal adezyon yüzdesi 5 ila -% 10; özellikle bu aralığın üstüne taban yapışma sorunlu bir deney belirtir ve T hücrelerinin başlangıç ​​popülasyonu spesifik olmayan hazırlanmasında önc…

Discussion

Düzgün T hücre yapışmasını analiz etmek için, uyarıcı bir in vitro yöntem seçerken dikkat edilmesi gereken çalışmaya dahil edilecek. LFA-1 aktivasyonu ve bağlayıcı ICAM-1 giden sinyalleri çalışma için çeşitli tahliller vardır birlikte tüm yöntemler değiştirilemez. Statik yapışma deneyi en iyi 10 T hücre-APC etkileşimleri çalışmak için uygundur; alternatif, burada ayrıntılı kayma gerilmesi yöntemi T hücresi epitel hücre etkileşimleri modellemek için idealdi…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The Rheumatology Research Foundation and the Hirschil Trust supported this work.

Materials

T cell samples (cell line or primary) ATCC TIB-152 Peripheral human T cells
CHO-ICAM-1 cells ATCC CRL-2093
µ-Slide VI 0.4 ibiTreat ibidi 80606
500 ml glass bottle Fisher FB800500
250 ml glass bottle Fisher FB800250
Silicone tubing 0.8 mm ibidi 10841
Confocal microscope with incubator chamber Ziess 700 Any wide field fluorescent microscope
Syringe pump New Era Pump Systems NE-300
60 ml syringe BD 309653
CFSE eBioscience 65-0850
SDF-1α R&D 350-NS-010/CF
RPMI Lonza 12-702F/12
PBS  Lonza 17-516F
Microcentrifuge Eppendorf  5424
D-Glucose Sigma Aldrich G8270 
PMA Sigma Aldrich 16561-29-8
Volocity software Perkin Elmer Version 6.2.1
ImageJ software NIH Version 1.48V
Tissue-culture treated culture dishes Falcon 353003
Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red Gibco 25200114
Heat Inactivated FBS Denville FB5001-H
Penicillin/Streptomycin Fisher BP295950

Referenzen

  1. Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Curr Opin Cell Biol. 20 (5), 525-532 (2008).
  2. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
  3. Dustin, M. L., Bivona, T. G., Philips, M. R. Membranes as messengers in T cell adhesion signaling. Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).
  4. Mor, A., Dustin, M. L., Philips, M. R. Small GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling. Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).
  5. Rose, D. M., Alon, R., Ginsberg, M. H. Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration. Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).
  6. Alon, R., Feigelson, S. W. Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts. Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).
  7. Su, W., et al. Rap1 and its effector RIAM are required for lymphocyte trafficking. Blood. 126 (25), 2695-2703 (2015).
  8. Judokusumo, E., Tabdanov, E., Kumari, S., Dustin, M. L., Kam, L. C. Mechanosensing in T lymphocyte activation. Biophys J. 102 (2), L5-L7 (2012).
  9. Zeltzer, E., et al. Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin. Nephrol Dial Transplant. 12 (12), 2618-2622 (1997).
  10. Strazza, M., Azoulay-Alfaguter, I., Pedoeem, A., Mor, A. Static adhesion assay for the study of integrin activation in T lymphocytes. J Vis Exp. (88), (2014).
  11. Ibidi GmbH. Shear stress and shear rates for ibidi μ-Slides – based on numerical calculations. Application Note 11. , (2014).
  12. van Gijsel-Bonnello, M., et al. Pantethine Alters Lipid Composition and Cholesterol Content of Membrane Rafts, With Down-Regulation of CXCL12-Induced T Cell Migration. J Cell Physiol. 230 (10), 2415-2425 (2015).
  13. Tozeren, A., et al. Micromanipulation of adhesion of phorbol 12-myristate-13-acetate-stimulated T lymphocytes to planar membranes containing intercellular adhesion molecule-1. Biophys J. 63 (1), 247-258 (1992).
  14. Mortier, A., Van Damme, J., Proost, P. Overview of the mechanisms regulating chemokine activity and availability. Immunol Lett. 145 (1-2), 2-9 (2012).
  15. Rot, A. In situ binding assay for studying chemokine interactions with endothelial cells. J Immunol Methods. 273 (1-2), 63-71 (2003).
  16. Yang, L., et al. ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow. Blood. 106 (2), 584-592 (2005).
  17. Long, E. O. ICAM-1: getting a grip on leukocyte adhesion. J Immunol. 186 (9), 5021-5023 (2011).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Strazza, M., Azoulay-Alfaguter, I., Peled, M., Mor, A. Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions. J. Vis. Exp. (112), e54203, doi:10.3791/54203 (2016).

View Video