휴대용 FRET 분석과 고감도 및 고속 형광 검출
Summary
이 프로토콜은 주문품 휴대용 FRET 분석기를 사용하여 포스터 공명 에너지 전달 (FRET) 센서 데이터의 신속한 고감도 정량 설명한다. 장치는 당도 실용적이고 효율적인 평가를 가능하게 검출 감도를 최대화하는 임계 온도 범위 내에서 말토오스를 검출하기 위해 사용 하였다.
Abstract
포스터 공명 에너지 전달이 최근 개선 (FRET) 센서는 이온 및 아미노산을 포함하여 다양한 작은 분자를 검출하기 위해 사용을 사용할 수있다. 그러나, FRET 센서의 본래 약한 신호 세기는 다양한 분야에의 응용을 방지하고 비싼 고성능의 사용이 필요하게 fluorometers 중요한 과제이다. 이전에, 우리는 특히 높은 검출 감도를 달성하기 위해 두 개의 발광 파장 대역 (530 및 480 ㎚)의 비율을 측정 할 수있는 경제적 인 고성능 FRET 분석 내장. 55 °의 C – 더 최근에는 세균의 세포질 단백질과 결합 FRET 센서 (50)의 임계 온도 범위에서 최대 감도 리간드를 검출하는 것이 발견되었다. 이 보고서는 온도 별 FRET 센서 우리 FRET 휴대용 분석기를 사용하여 시판 음료 샘플 당 함량을 평가하기위한 프로토콜을 설명한다. 우리의 결과는 추가 예열 것으로 나타났다프렛 센서의 과정은 상당히 당도의보다 정확한 측정을 가능하게하려면 FRET 비율 신호를 증가시킨다. 주문품 FRET 분석과 센서 성공적 상용 음료의 세 종류의 당 함량을 정량하기 위해 적용 하였다. 우리는 하이 엔드 장비는 가능하지 않은 장치의 추가적인 소형화 및 성능 향상이 환경에서 휴대용 분석기의 사용을 용이하게 할 것으로 예상된다.
Introduction
포스터 공명 에너지 전달 (FRET)을 널리 당, 칼슘 이온, 아미노산 1-4와 같은 작은 분자를 검출하는 바이오 센서로서 사용되어왔다. FRET 바이오 센서는 형광 단백질, 시안 형광 단백질 (CFP들), 및 주변 세포질 결합 단백질 (PBPs)의 양단에 융합 노란색 형광 단백질 (YFPs)를 포함한다. 당류는 이후 PBPs 양쪽 끝에 두 형광 단백질의 거리 및 전이 쌍극자의 방향을 변경하는 센서의 구조 변화를 일으키는 FRET 센서의 중앙에 위치 PBPs 바인딩. 이러한 변화는 EYFP (530 ㎚) 및 ECFP (480 ㎚)의 발광 파장의 비율을 측정함으로써, 당 함량의 정량 분석을 가능하게한다. 높은 민감도, 특이도, 실시간 모니터링 능력 및 FRET 바이오 센서의 빠른 응답 시간으로 인해, 이러한 센서는 크게, 환경 산업, 의료 분야 5에 사용된다. 또한, ratiom이 센서의 농도를 용이하게 제어 및 배경 형광이 항상 존재할 수없는 복잡한 생물학적 시료의 성분을 측정하기 위해 사용될 수있다 FRET 바이오 센서를 사용하여 측정 etric 중요한 실용적인 장점을 갖는다.
양적 시각화를위한 FRET 기반 센서의 이러한 장점에도 불구하고, 형광 단백질에 불완전 도메인 모션 전송 작은 구조적 변화는 본질적으로 약한 신호 강도를 생산하고 있습니다. 이 약한 신호는 시험 관내 또는 생체 내 분석 6 FRET 기반 센서의 적용을 제한합니다. 따라서, 대부분의 바이오 센서가 고가 민감한 장비를 사용해야 FRET. 이전에는, 기존 형광 분석기 (7)의 것과 유사한 기능을 저렴하고 휴대용 FRET 분석을 개발 하였다. 이 장치 저렴 405 nm의 대역 자외선 발광 다이오드 (LED)에서는 제의 여기를 야기하는 광원으로서 사용 된즉 형광 신호 고가 램프 또는 레이저를 교체. 광자의 검출 시스템은 효율적으로 실리콘 광 다이오드 두 광 검출기 상으로 발산 형광 신호를 집중한다. 55 ° C를 크게 비율 계량 FRET 신호 (8)을 확대 할 수 – 더 최근의 연구에서 우리는 50에서 검출 온도의 최적화는 것을 보여 주었다. 이 온도 별 신호 향상은 맞춤형 FRET 분석과 함께 신속한 고감도 일반적인 진단 애플리케이션 FRET 센서의 사용을 가능하게한다.
이 프로토콜에서는 시판 음료의 당 함량을 정량함으로써 FRET 최적 온도 조건 하에서 분석 FRET의 일반적인 적용 가능성을 보여 주었다. 이 프로토콜은 FRET 장치 동작의 세부 사항뿐만 아니라 센서 샘플 준비에 대한 간략한 설명을 제공한다. 우리는이 보고서는 휴대용의 잠재적 인 응용 프로그램을 촉진 것으로 예상소규모 실험실 환경 분석기 FRET 기반 바이오 센서와 저가의 현장 진단 장치의 추가 개발을위한 기반을 제공한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 FRET 센서 최적 온도 주문품 FRET 분석 장치 (7)를 이용하여 음료 샘플 당 농도의 신속하고 효율적인 정량화를 허용한다. 이 분석기는 최근에 개발 된 저렴한 405 나노 밴드 광원 및 실리콘 포토 다이오드와 두 개의 광 검출기로 자외선이-LED 설계되었습니다. 이 장치는보다 비용 효율적인 다른 비교 fluorometers보다. FRET 센서를위한 최적의 온도 범위에서 두 개의 발광 파장 대역 (53…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 글로벌 프론티어 사업 (2011-0031944)과 KRIBB 연구 이니셔티브 프로그램의 지능형 합성 생물학 센터에서 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| LB | BD | #244620 | |
| isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) | Sigma | I6758 | |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Tri-HCl | Bioneer | C-9006-1 | |
| PMSF | Sigma | 78830 | |
| EDTA | Bioneer | C-9007 | |
| DTT | Sigma | D0632 | |
| NaCl | Junsei | 19015-0350 | |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 70011-044 | 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4 |
| SOC | 2% tryptone, 0.5% Yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MGCl2, 20 mM Glucose | ||
| Resource Q | Amersham Biosciences | 17-1177-01 | 6 × 30 mm anion-exchange chromatography column |
| HisTrap HP1 | Amersham Biosciences | 29-0510-21 | |
| Quartz cuvette | Sigma | Z802875 | |
| AKÄKTAFPLC | Amersham Biosciences | 18-1900-26 | a fast protein liquid chromatography (FPLC) |
| Cary Eclipse | VarianInc | a fluorescence spectrophotometer | |
| VICTOR | PerkinElmer | 2030-0050 | a multilabel plate reader |
| E. coli JM109 (DE3) | Promega | Electrocompetent cells | |
| A (Beverage) | Korea Yakult Co. (Korea) | Birak | Fermented drinks |
| B (Beverage) | Lotte Foods (Korea) | Epro | Soft drink |
| C (Beverage) | Lotte Foods (Korea) | Getoray | Sports drink |
Referenzen
- Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering. Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).
- Ha, J. S., Song, J. J., Lee, Y. M., Kim, S. J., Sohn, J. H., Shin, C. S., Lee, S. G. Design and application of highly responsive fluorescence resonance energy transfer biosensors for detection of sugar in living Saccharomyces cerevisiae cells. Appl. Environ. Microbiol. 73 (22), 7408-7414 (2007).
- Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (29), 10554-10559 (2004).
- Okumoto, S., Looger, L. L., Micheva, K. D., Reimer, R. J., Smith, S. J., Frommer, W. B. Detection of glutamate release from neurons by genetically encoded surface-displayed FRET nanosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (24), 8740-8745 (2005).
- Merzlyakov, M., Li, E., Casas, R., Hristova, K. Spectral Förster resonance energy transfer detection of protein interactions in surface-supported bilayers. Langmuir. 22 (16), 6986-6992 (2006).
- Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3 (12), 906-918 (2002).
- Kim, H., Kim, H. S., Ha, J. S., Lee, S. G. A portable FRET analyzer for rapid detection of sugar content. Analyst. 140 (10), 3384-3389 (2015).
- Gam, J., Ha, J. -. S., Kim, H., Lee, D. -. H., Lee, J., Lee, S. -. G. Ratiometric analyses at critical temperatures can magnify the signal intensity of FRET-based sugar sensors with periplasmic binding proteins. Biosens. Bioelectron. 72, 37-43 (2015).
- Hessels, A. M., Merkx, M. Genetically-encoded FRET-based sensors for monitoring Zn2+ in living cells. Metallomics. 7 (2), 258-266 (2015).
- Song, Y., Yang, M., Wegner, S. V., Zhao, J., Zhu, R., Wu, Y., He, C., Chen, P. R. A genetically encoded FRET sensor for intracellular heme. ACS Chem. Biol. 10 (7), 1610-1615 (2015).
- . Fluorescent Protein Guide: Biosensors Available from: https://www.addgene.org/fluorescent-proteins/biosensors/ (2015)
- Rajendran, R., Rayman, G. Point-of-care blood glucose testing for diabetes care in hospitalized patients: an evidence-based review. J. Diabetes Sci. Technol. 8 (6), 1081-1090 (2014).
- Vyas, N. K., Vyas, M. N., Quiocho, F. A. Sugar and signal-transducer binding sites of the Escherichia coli galactose chemoreceptor protein. Science. 242, 1290-1295 (1988).
- Leermakers, E. T. M., Felix, J. F., Erler, N. S., Ċerimagić, A., Wijtzes, A. I., Hofman, A., Raat, H., Moll, H. A., Rivadeneira, F., Jaddoe, V. W., Franco, O. H., Kiefte-de Jong, J. C. Sugar-containing beverage intake in toddlers and body composition up to age 6 years: The Generation R Study. Eur. J. Clin. Nutr. 69 (3), 314-321 (2015).
- Shilts, M., Styne, D., Drake, C., Aden, C., Townsend, M. Fast food, fat and sugar sweetened beverage items are related to children’s dietary energy density. FASEB J. 29 (1), 731-736 (2015).
- Larsson, S. C., Åkesson, A., Wolk, A. Sweetened beverage consumption is associated with increased risk of stroke in women and men. J Nutr. 144 (6), 856-860 (2014).
- Melkko, S., Neri, D., Vaillancourt, P. E. Calmodulin as an affinity purification tag. E. coli Gene Expression Protocols. , 69-77 (2003).
