がんの確立は、ヒト従来の骨肉腫からの幹細胞培養物

本明細書に記載されたヒト組織を用いたすべての実験は地域の倫理委員会（リフ。N. 12分の141）によって承認されました。組織サンプルの収集のためのサンプルの使用および貯蔵のためのインフォームドコンセントをAOUCにドナーから得ました。 文化1.準備 10％ウシ胎児血清（FBS）、100 IU / mlのペニシリンおよびクーンの改変ハムF12培地に100μg/ mlのストレプトマイシンを追加することによって、成長培地（GM）を準備します。濾過し、0.22μmのフィルターを使用してGMを殺菌。 4℃で1ヶ月まで保存GM。 クーンの改変ハムF12培地に、20％FBS、100 IU / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシンおよび3 mg / mlでコラゲナーゼII型を追加することによって、コラゲナーゼ培地（CM）を調製します。濾過し、0.22μmのフィルターを使用してCMを殺菌。最大1ヶ月まで-20℃で保存CM。 100μg/ mlのストレプトマイシンおよび6、FBS、100IU / mlのペニシリンを40％添加することにより（FM）の凍結細胞のための培地を調製クーンの改変ハムF12培地に.5％のジメチルスルホキシド（DMSO）。フィルタと0.22μmのフィルターを使用してFMを殺菌。最大1ヶ月まで4℃で保存FM。 クーンの修正されたハムF12培地に20％FBS、100 IU / mlのペニシリンおよび100μg/ mlストレプトマイシンを添加することにより、CFUアッセイ（CFUM）のための媒体を準備します。フィルタと0.22μmのフィルターを使用してCFUMを殺菌。 4℃で1ヶ月まで保存CFUM。 2+ の Ca 2+およびMgなし千中のグルコース無水ミリリットルダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS） – 400 mgのトリプシン、200mgのEDTA及び1,000mgののD（+）を溶解することにより、トリプシンを準備します。 注：0.22μmのフィルターを用いて、25cm 2のフラスコ中の50mlアリコートに、新鮮なトリプシンEDTAを分割し、3ヶ月まで-20℃で凍結します。ストアは、活性の損失なしに4℃で濾過滅菌し、アリコートを解凍しました。 、100 IU / mlペニシリン、100μg/ mlのstreptom 10％FBSを添加することにより、幹細胞成長培地（SCGM）を調製クーンの修正されたハムF12培地にycin、および10 ngの/ mlのbFGF（25 / mlのストック）。 4℃で2週間まで0.22μmフィルターとストアSCGMを使用してSCGMをフィルタリングします。 3日間4℃での超純H 2 OでMCを溶解させることにより2％メチルセルロース（MC）を準備します。 MCが完全に溶解されたとき、それをオートクレーブし、4℃で保存。 注記：MCは、滅菌された後、それは固体になります。 4℃で液体状態、店にMCをもたらすために。 sarcosphere成長培地（SGM）を準備します。 100 IU / mlのペニシリンを追加することによって、この培地の新鮮な（使用前にはない2週間以上）を準備し、100μg/ mlのヒトbFGF（25 / mlのストック）、20 nMのプロゲステロン（10μMストック）、100μMのプトレシン、30 nMの亜セレン酸ナトリウム（30μMストック）、25μgの2X / mlのトランスフェリン（25 mg / mlでストック）、20 / mlのインスリン（20 mg / mlでストック）、および10ng / mLのヒトEGF（10μgの/ mLのストック）クーンのは、ハムF12培地を変更しました。 0.22μmのフィルを使用してSGMを濾過し、滅菌ター。 4℃で最大2週間保管してください。 、100μg/ mlのストレプトマイシンを100 IU / mlのペニシリンを10％FBS（南アメリカの原点）を追加することにより、骨形成培地（OM）を準備し、10 nMのデキサメタゾン（100μMストック）、0.2 mMのナトリウムL-アスコルビン酸-2-リン酸（1 Mストック）、クーンの修正ハムF12培地に10mMのβグリセロリン酸（5 mg / mlでストック）および1 / mlのカルセイン（200 / mlのストック）。フィルタと0.22μmのフィルターを使用して、OMを殺菌。 4℃で保存。 注：液体窒素下で保存デキサメタゾンストック溶液は、それらの活性を維持します。媒体の分化能を維持するために、デキサメタゾンの活性を維持するために2週間ごとに新鮮なOMを準備します。 1.66 mgのNH 4 Clで、水（のdH 2 O）を200mlの蒸留中の0.2mgのK 2 HPO 4および0.007ミリグラムのEDTAを溶解することにより赤血球溶解バッファー（ELB）を準備します。濾過し、0.22μmのフィルターを使用してELBを殺菌。 4°で保存C. 追加することによって、脂肪生成培地（AM）を準備し、10％FBS（南米由来）、100 IU / mlのペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、1μMデキサメタゾン（1 mMストック）、1μMのウシインスリン（10 mMストック）、0.5 mMのイソブチルメチルキサンチン（IBMX）（500 mMストック）、および100μMのインドメタシン（200 mM）のクーンの修正ハムF12培地に。濾過し、0.22μmのフィルターを使用してAMを殺菌。 4℃で保存。 注：液体窒素下で保存デキサメタゾンストック溶液は、それらの活性を維持します。媒体の分化能を維持するために、デキサメタゾンの活性を維持するために2週間ごとに新鮮なAMを準備します。 調製2％DPBSでウシ血清アルブミン（BSA）（BSA / DPBS）。 500ミリリットルのDPBS中の10グラムのBSAを溶解し、50mlコニカルチューブに50ミリリットルストック溶液を等分することによってストック溶液を調製。 -20℃で保管してください。 DPBS（PFA / DPBS）中の4％パラホルムアルデヒド（PFA）の溶液を調製します。 CHでemicalフードは、DPBS中でパラホルムアルデヒドを希釈し、50ミリリットルコニカルチューブに50ミリリットルストック溶液を等分することによってストック溶液を調製します。 4℃で保存。 2.プライマリOS細胞培養およびOS有限細胞株（OSA）の確立 注：プライマリOS細胞培養物」は、UNITA Ortopedia Oncologica電子のRicostruttiva」、AOUC Careggi、フィレンツェで収集し、従来のOS生検の新鮮なサンプルから調製しました。針吸引または腫瘍（ 図1A、B）の小部分の外科的切除によって得られたすべての生検は、すぐに100 IU / mlペニシリンおよび100μg/ mlストレプトマイシン液（pH7.4）で補充した培地中に入れましたそれらが処理された実験室に輸送しました。全て記載操作は、層流フードを使用して無菌条件下で行いました。 OS細胞の単離 生検を配置GMの小容量と100ミリメートルペトリ皿。滅菌ランセット及びペリーピンセットを用いて、できるだけ小さな断片にそれらを切断することにより、OSの組織サンプルをみじん切り（0.8 – 1 mm）の（ 図2A、B）。 酵素消化（ 図2B）を10 mLのCMで組織片を覆い、37℃、5％CO 2インキュベーター内で3時間インキュベートします。静かにピペットを用いて、フラグメントのサスペンションを削除し、その断片をペレット化（5分間400×gで）即時の遠心分離のために15ミリリットルコニカルチューブに移します。 注：生検は、赤血球が豊富であれば遠心分離した後、赤血球から成る赤デポジットが断片上で見ることができます。したがって、機械的分散に進む前に、赤血球溶解緩衝液で試料を処置します。吸引により上清を捨て、5ミリリットルELBを追加します。 1分間ペレットの断片を一時停止し、2、400×gで懸濁液を遠心分離分。吸引により上清を取り除きます。 5ミリリットルGMを追加して、機械的に血清学的ピペット（開口サイズ、1.5ミリメートル内部Ø）10ミリリットルを使用して断片を分散させる10から20回。 5分間400×gで懸濁液を遠心。 、吸引により上清を除去し10ミリリットルGMと細胞ペレットを中断し、その後100ミリメートルペトリ皿に得られた細胞懸濁液を移します。 37°C、5％CO 2インキュベーター内でペトリ皿をインキュベートし、新鮮な完全GMとGMを3日毎に交換してください。 注意：かなり頻繁に、針吸引によって得られたOSの組織試料は、非常に小さく、コラゲナーゼで酵素消化により消化されていない骨片を含みます。上清を除去した後従って、ピペットでペレット断片を叩解することによって骨組織から細胞を分離することを試みます。 サブカルチャー注：細胞がおおよそのコンフルエンスに達したときにOSAを確立するには、theiからそれらを削除r個の培養容器は、希釈し、さらなる成長を可能にするために、新鮮なプレートに配置します。この継代培養手順は、トリプシン処理と呼ばれる酵素の手順を用いて達成されます。 吸引により培地を除去します。 、 – （20°C最大18）軽く一回振ると、吸引によってすぐにトリプシンを除去し、室温で3 mlのトリプシン – 細胞単層を分離するには、2を追加します。二回繰り返します。彼らはデタッチし始めるまで、4分間 – 3 37℃で細胞をインキュベートします。 注：良いトリプシン処理は、皿が光に保持されているときに小さな穴がわずかに不透明な単層で形成するものとして経験のあるユーザーが見ることができます。この解離はまた、倒立顕微鏡を用いてモニターすることができます。このアプローチは、初心者にお勧めです。 10ミリリットルのGMを追加することにより、トリプシン反応を停止し、すべての細胞を剥離するためにピペットを用いてウェルディッシュを洗います。新しい100ミリメートルペトリ皿に移し懸濁液1mlをし、9ミリリットルGM（セルの1/10分割）を追加します。 注意： </stroNG>残りの細胞懸濁液は、細胞増殖（さらに100 mmのペトリ皿への転送）のために使用することができる（参照（セクション2.3を参照）を凍結保存することができ、または増殖アッセイまたは他の目的のために計数し、実験皿またはウェルに播種することができます以下）。 OS初代培養およびOSAの凍結保存 注：4-5クライオバイアルに1コンフルエント100ミリメートルペトリ皿をフリーズします。凍結中の細胞膜を保護し、DMSOは、非凍結温度での細胞に毒性であるため、凍結保存の処理が迅速に行わなければなりません。 トリプシン処理により単層からの細胞培養物を解離、5分間400×gで遠心分離することによって、ペレット細胞を（2.2節を参照）吸引により上清を除去し、その後すぐにFMで細胞ペレットを中断。 アリコート極低温バイアル当たりこの懸濁液の1ミリリットル。すぐに2-プロパノール及び店舗immediaのジャケットを冷凍庫ボックスに充填したバイアルを置きますtely -80 CO / N°。転送は、液体窒素に長期保存のために翌日にクリオバイアル。 デフロストOS細胞株および初代培養 液体窒素保存から解凍OS細胞株を、37℃の実験室の水浴中に置くことにより、急速に解凍クライオバイアル。 （DMSOを除去するために、2.3節を参照してください）15ミリリットルコニカルチューブにクライオバイアルの内容を転送し、GMの約10ミリリットルを追加します。吸引により上清を除去し、10ミリリットルのGMで細胞ペレットを中断。プレート100 mmのペトリ皿中の細胞懸濁液を、37℃、5％CO 2インキュベーター内でインキュベートします。 アイソOS-のCSC 3. Sarcosphereアッセイ 注記：この実験は、OSA上で実行されます。この実験の持続時間は、これらの球コロニー（sarcospheres）を形成する細胞の能力に関連する、時間の範囲、7、14、21、及び28日です。 ESTABsarcosphereアッセイのlishment 血球計室と事前に全ての試薬を準備します。 （2.2節を参照）を吸引により培地を除去し、トリプシン処理により単層から細胞を解離します。ピペッティングは、任意の塊を分散し、20μLのピペットチップを使用して10μLを収集するために、徹底的に細胞懸濁液を混ぜます。 、血球計数器のチャンバの端に直ちに10μlの細胞懸濁液を転送懸濁液を排出し、それは毛管作用によりカバースリップの下で描画することを可能にします。 位相コントラストの下で血球計数器チャンバーを観察します。 10倍対物レンズを選択し、チャンバー内のグリッド線に焦点を当てます。カウント用の補助としてサブディビジョン（また、3本の平行線によって結合された）と、単一のグリッド線を使用して、この1ミリメートル2領域に横たわって細胞を数えます。 濃度を測定し、次式適用：1ミリリットル= N * 10 4 / Z（nはすべてカウント中の細胞の全体数を正方形1ミリメートル2。 Z：カウント正方形1ミリメートル2）の数。 6穴超低接着プレートにウェル毎に40,000セルに分割24万細胞の総量をプレートに必要な細胞懸濁液の体積を計算します。 注：1つの余分なウェルに細胞をプレーティングすることによって、細胞の正確な数をめっきしてください。そのため、めっきされるべき細胞の総量は28万細胞です。 25cm 2のフラスコ中で、2％MC（SGM-MC）の50％を追加することで、35ミリリットルSGMを準備します。 1つの余分な井戸をめっきするために、余分な5ミリリットルを考慮しSGMの全体積を準備します。 フラスコ中で調製SGM-MCへの細胞懸濁液の計算されたボリュームを追加し、任意の塊を分散させるためにピペットを用いて穏やかに混合します。 6ウェル超低接着プレートに細胞をプレーし、メッキされた後、細胞がどのように表示されるかを観察するために倒立顕微鏡を使用しています。 37℃、5％CO 2インキュベーター中で細胞をインキュベートします。すべての3 dは、FRを追加します成長因子の濃度をリフレッシュするために、各ウェルにbFGFおよびEGFのESHアリコート。各ウェル中の10ng / mlの最終濃度での両方を維持するために2μLbFGFおよび5μLEGFを追加します。 sarcospheresの単離 注：形成されsarcospheresを隔離する必要がある場合を決定するために7、14、21、および28日でsarcosphereアッセイの良好な進行状況を監視します。 層流フード（ 図3A、B）内のすべての試薬や機器を準備します。メンブレンフィルターホルダーに直径25mmと40μmのメッシュのネットフィルタを配置することによって濾過ユニットを組み立てます。オートクレーブ処理（ 図4A-E）で滅菌します。 ウェルごとに1,000μLチップで滅菌ピペットを用いて滅菌メンブレンフィルターホルダーをシリンジにsarcospheresを含む培地を移します。完全sarcospheresを含む培地を除去した後、アドオンによってよく洗います5ミリリットルGMをると、注射器にすべての球を転送するようにしてくださいします。すべてsarcospheresが回復されているかどうかを確認するために顕微鏡を使用してください。そうでない場合、この手順を繰り返して進みます。 球体の損傷を防ぐために、それによって球の損失を回避し、フィルターを通して交差sarcospheresを回避するために、圧力をかけず重力のみによってメンブレンフィルターホルダーとサスペンションをフィルタリングします。静かに滅菌ガラスパスツールピペットを使用して気泡を除去。 注：時々ろ過は、膜フィルターホルダーにおける気泡の存在によって遮断されます。 シリンジに10ミリリットルのGMを追加し、それが単一細胞を排除することを確認するために圧力をかけずフィルタリングさせることによって濾過ユニットを洗ってください。シリンジからフィルターユニットを離れて取り、ペトリ皿に入れて。 ペリーピンセットを用いた膜フィルターホルダーからネットフィルターを外して60ミリメートルにピンセットで軽く振ってそれを洗います膜のもつれからsarcospheresを解放するためにペトリ皿。その後、ウェル内膜を配置し、膜に絡まっそれ以上の球がないことを顕微鏡観察により確認します。球がまだ膜に絡まっている場合はステップ3.2.4で説明したように、別の洗浄を進めます。 顕微鏡を使用してリリースしsarcospheresを守ってください。 37℃、5％CO 2インキュベーターでリリースsarcospheresをインキュベートします。 6ウェル超低接着プレートの各ウェルのためのすべての手順を繰り返します。 4. OS-CSC行 注：OS-のCSCは、それらは、超低接着条件下でもはや小60ミリメートルペトリ皿にプレートされた後、単層でこれらの細胞を再導入しないと再培養することにより接着性、拡張性を示すsarcospheresから得られます。 OS-CSCの文化 彼らは60で約90％コンフルエンスに達したときに、さらなる成長、継代培養細胞を有効にするにはミリメートルペトリ皿。 OS-CSCの文化を確立するための手順を繰り返し2.2.1。 4ミリリットルSCGMを追加することにより、トリプシン処理を停止し、すべての細胞を剥離するためにピペットを用いて、ウェルディッシュを洗います。新しい100ミリメートルペトリ皿に細胞懸濁液を移し、6ミリリットルSCGMを追加します。 OS-のCSCは、セクション2.2を繰り返すことにより、90％コンフルエンス、サブカルチャーに達すると。 注：単離されたOS-のCSCの幹細胞様の表現型を特徴付けるためのインビトロ分析のために、細胞をプレートの異なるタイプに播種することができます。 （セクション2.3のすべての手順を繰り返し）凍結保存によって確立されたOS-CSCラインを保持します。セクション2.4のすべてのステップを繰り返すことによって、凍結保存されたOS-のCSCを解凍。 5. インビトロA nalysis OS-のCSCを特徴付けるために： 免疫蛍光のための細胞の調製 注：彼らは24ウェルナンプラーの各ウェルに合流の右等級に達したとき、細胞をパラホルムアルデヒドで固定されています。TE。合流のグレードは、実験の種類に関係しています。 免疫蛍光法によって表面間葉系幹細胞（MSC）のマーカーを研究するために、24ウェルプレート中のプレートのOS-のCSC。 60％コンフルエンス – 彼らは50に到達したときに、各ウェルの細胞を修正しました。吸引によってSCGMを削除し、DPBS 24ウェルプレート中で二回洗います。 化学フードの下で、各ウェルに500μLの4％PFA / DPBSを追加します。室温で10分間インキュベートします。 PFA / DPBSを削除して、超高純度の dH 2 Oで3回洗浄24ウェルプレートは、ドラフト内で乾燥することができます。 MSCマーカーの免疫蛍光 注：4％PFA / DPBSで固定OS-のCSCの免疫蛍光染色は、CD44、STRO-1およびCD105に対する抗体を用いたOS-のCSCのMSC様の表現型を調べるために使用することができます。以下の方法は、筆者らが日常的に使用されます。 化学フードでは、500μL0.2を追加することにより、4％PFA / DPBSで固定されている細胞を透過性％トリトンX-100 / DPBSを各ウェルに。 37℃で30分間細胞をインキュベートします。優しく細胞はDPBSで3回洗浄します。追加300μLのRNaseを細胞に2％BSA / DPBSで1 / 1,000に希釈し、30分間37℃でインキュベートします。 静かに2％BSA / DPBSで3回細胞を洗浄します。 MSCマーカーについて細胞を染色。唯一の各抗体のための陽性対照として選ばれたウェルに一次抗体を追加します。 抗CD105は、2％BSA / DPBSで1/10に希釈し、300μLを追加し、300μL抗CD44は、2％BSA / DPBSで1/10に希釈し、300μLの抗STRO-1の2％BSA / DPBSで1/10に希釈しそして唯一の200μLの2％BSA / DPBS各抗体のための陰性対照として選ばれたウェルに。 4°CO / Nで湿潤環境下で細胞をインキュベートします。ウェルを2％BSA / DPBSで二回、その後DPBSで3倍と洗ってください。 具体的な二次抗体を添加することにより、一次抗体を明らかにしました。 300μLの抗ウサギIgGを（ロバ抗ウサギIgGの[H + 1]）を1/100に希釈した追加2％BSA / DPBSで各ウェルCD44およびCD105に対する陽性および陰性対照として選ばへ。追加300μLのFITC抗マウスIg（FITCウサギ抗マウスIgG [H + L]）を各ウェルにSTRO-1陽性および陰性対照として選択中の2％BSA / DPBSで1/100に希釈しました。 60分間室温で暗所で細胞をインキュベートします。ウェルをDPBSで6倍洗います。 300μLを添加することにより、細胞骨格アクチン染色するMSCマーカー陽性細胞は、MSCマーカー免疫蛍光のために各ウェルに染色に2％BSA / DPBSで1/100に希釈したファロイジン。 RTで40分間細胞をインキュベートします。ウェルをDPBSで3回洗浄した後、超純の dH 2 Oで二回洗って上記の免疫蛍光染色後の核の対比染色に進みます。ドラフト内でヨウ化プロピジウム溶液をDPBS中10 -5 M（株1.5×10 -3 M）を準備します。 上記のようにうまく色のそれぞれに200μLヨウ化プロピジウム溶液を加えます。細胞をインキュベートRTで3分間 – 2秒。超純の dH 2 Oでウェルを2回洗浄 注：セクション5.1のすべての手順を繰り返し- 5.2細胞株HCT8、ネガティブコントロールとして使用される主連続分化した結腸癌細胞株に。 骨形成分化アッセイ注：骨形成分化は20日間持続します。 SCCGM 1×10 4細胞/ cm 2の細胞密度で24ウェルプレート中にプレートOSは、CSCを。各ウェルに90％の密集度 – 彼らは80に達するまで細胞がSCGMに成長することを可能にします。 OMにSCGMを変更することにより、骨形成分化を開始します。 4日間 – 細胞がOMに成長し、メディアごとに3を更新することができます。アルカリホスファターゼ（ALP）の存在を評価するために、10日間で骨形成分化アッセイを停止します。 4％PFA / DPBSで細胞を固定（5.1節を参照してください）。 ALPのためにとHAのために細胞化学染色により骨芽細胞表現型を評価しますアリザリンレッドS染色を用いて。 ALP細胞化学染色 注：すぐに染色を開始する前に、化学フード内の染料混合物を準備します。 40 mgのファーストブルーBBまたは50ミリリットルのTris-HCl、pHが9（溶液A）におけるファストレッドバイオレットLB塩を溶解させます。 DMSO 1 ml中（溶液B）中5mgナフトールAS-MXリン酸ナトリウム塩を溶解します。完全に溶液Aに溶液Bを加え、よく混ぜ、DPBSで二回ソリューションC.洗浄細胞を得ます。 各ウェルに1ミリリットル溶液Cと37°Cでインキュベートし、5％CO 2から500μLを追加します。顕微鏡下で細胞を観察することにより、10分毎に染色する過程を監視します。 ALP陽性細胞が激しく、通常30分以内に発生する、（ファストレッドバイオレットLB塩とのファーストブルーBB塩または赤と青）のカラーになったときに、染色を停止します。細胞は染色iの沈殿物場合は溶液Cのすべての残留物を除去するために超高純度のdH 2 Oで3回洗浄し現在のは、無水エタノールで速やかに細胞を1回洗浄します。 ステップ5.2.5および5.2.5.1に記載されているようにALP染色後の核の対比染色に進みます。 アリザリンレッドS細胞化学染色 注：実験を開始する前に、染料混合物を準備します。 （超純H 2 Oの100ミリリットルで2グラムアリザリンレッドS）2％アリザリンレッドSを準備します。 pHが6.0に到達するために2％アリザリンレッドSに2.5％NH 3を追加します。 4°Cで保存し、2％アリザリンレッドS溶液。 DPBSで細胞を1回洗浄します。 ほんの数秒のために細胞にアリザリンレッドSを追加します。 染色の程度を制御するために、超高純度のdH 2 Oでウェルを洗浄します。 HA預金が強く着色されていない場合、ステップ5.3.5.2を繰り返します。通常は数分以内に発生したHA預金が着色激しく赤くなり染色を、停止します。超純のdH 2 Oでウェルを洗浄</li> 脂肪細胞への分化 注：アッセイ期間は、OS-CSC回線に依存します。 30 D – アッセイは、14を最後にすることができます。 SCGM 1×10 4細胞/ cm 2の細胞密度で24ウェルプレート中にプレートOSは、CSCを。各ウェルに90％の密集度 – 彼らは80に達するまで細胞がSCGMに成長することを可能にします。 AMにSCGMを変更することにより、脂肪細胞への分化を開始します。細胞がAMに成長し、週に2回AMをリフレッシュすることができます。 脂質小胞が表示されているときに脂肪細胞への分化アッセイを停止します。オイルレッドO染色による核のために対比ヘマトキシリンにより脂肪生成表現型を評価します。 核のためのヘマトキシリンの対比 注：実験を開始する前に、染料混合物を準備します。 Emallume Carazzi 39と呼ばれる5％のヘマトキシリン液を準備します。 4℃で溶液を保管してください。わずか2分間Emallume Carazziを追加します。 ULTでウェルを洗浄rapureのdH 2 O CFUアッセイ 注：この実験は三連で実行する必要があります。 プレートOS-CSCを100 mmのペトリ皿中でCFUM / cm 2で450細胞の細胞密度で。 4週間37℃、5％CO 2インキュベーター中で細胞をインキュベートします。週に2回CFUMを更新します。 トルイジンブルーでのCFUを染色します。倒立顕微鏡を用いて着色されたコロニーを数えます。以下の式に従ってCFU効率を計算する：（コロニー数を形成/播種した細胞の数）* 100。 ALDHの活性分析 注：ALDH活性は、二つのOS-CSCライン上及び陰性対照として使用した有限の線維芽細胞株、のALDH活性を比色アッセイキットを使用して評価されています。このキットは、450nmで読んだの吸光度によってALDH酵素活性を定量化します。すべての試験は三重に行われています。 トリプシン処理により単層からの細胞培養物を解離（2.2節を参照してください）。 5分間400×gでの遠心分離によって細胞をペレット。製造業者のプロトコルに従ってください。 フローサイトメトリー分析： 注：単一細胞懸濁液をフローサイトメトリーのためのサンプルの最適な染色のために必要とされます。単一細胞懸濁液は、試験される各抗体のために準備する必要があります。トリプシン処理により単層からの細胞培養物を解離（2.2節を参照してください）。 / 1×10 5細胞の最終細胞濃度で、細胞懸濁液を得るために、分離緩衝液の適切な容積チャンバを数えるBürkerを用いて細胞数、遠心セル400×gで再懸濁を行って、コニカルチューブに細胞懸濁液を置きミリリットル。 遠心機で4℃で5分間細胞懸濁液。上清を捨て、分離緩衝液でペレットを洗浄。二回、この手順を繰り返します。 MSのための染色細胞Cマーカー（ すなわち 、CD44、CD105及びSTRO-1）40。 フローサイトメーターで陽性に染色された細胞懸濁液を分析します。 1 D内でマークされたサンプルを分析します。分析まで4℃でこれらのサンプルをインキュベートします。 RT-PCR RNAの抽出および単離 OS-のCSCの細胞冷凍パックのサンプルに1ミリリットルの溶解試薬を加え、上下に数回ペレットをピペッティングすることにより、チューブ内で直接細胞を溶解。 4℃で1分間、12,000×gでサンプルを遠心。静かに上清を除去します。上清を新しいチューブに移し、200μlのクロロホルムを追加し、安全にチューブをキャップ。 15秒間激しくチューブを振るし、室温で5分間サンプルをインキュベートします。 4℃で15分間、12,000×gでサンプルを遠心。混合物は、3つの異なる相に分離します。 RNAは、無色の上部の水相中にもっぱらあります。 PAビーイングrticularly慎重に、水相のみを除去し、RNA単離を進めるために新しいチューブにこのフェーズを移します。水相を含むチューブに500μLのイソプロパノールを追加します。手で軽くチューブを振ります。室温で10分間サンプルをインキュベートします。 4℃で10分間、12,000×gでサンプルを遠心。 注：サンプルを遠心分離した後、それは側チューブの底にゲル状のペレットを形成するRNAを、見ることが可能です。 底のRNAのペレットを残すように注意しながら、チューブから上清を取り除きます。チューブに1ミリリットルの75％エタノールを追加します。ボルテックス数秒間手で管した後、4℃で5分間、7500×gでチューブを遠心します。 RNAペレットを乾燥エタノールと空気を捨てます。上下に数回ソリューションをピペッティングすることによって – （50μL10）ペレットが乾燥しているときは、RNaseフリー水でRNAペレットを再懸濁します。 MEASによってRNAの収量および純度を決定260nmで分光光度計を用いて280nmでの吸光度をuring。標準1％アガロースゲル上の全RNAの完全性を評価します。 -80℃でRNAを保管してください。 逆ポリメラーゼ連鎖反応 逆転写キットを用いて、500 ngのRNAをサンプルから第一鎖cDNAを合成します。氷上で解凍RNAサンプルとは、室温で、キットに含まれ、必要なソリューションを解凍します。製造業者のプロトコルに従ってcDNAを合成するために進んでください。 半定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR） 24μLの最終反応容量で鋳型として各サンプルについて1μLのcDNAを使用して、すべてのPCRを行います。 Nanogを、10月3月4日、SOX2、およびCD133遺伝子の増幅のために、表1に記載されたプライマー配列を使用してください。 臭化エチジウムで1.8％アガロースゲル電気泳動および染色によってRT-PCR産物を分離します。 UVイルミネーションの下で写真ネーション。