La cuantificación de la actina filamentosa (F-actina) puntos lagrimales en las neuronas corticales de rata
Summary
Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.
Abstract
proteína actina filamentosa (F-actina) juega un papel importante en espinogénesis, la plasticidad sináptica, y la estabilidad sináptica. Los cambios en las estructuras dendríticas ricas F-actina sugieren alteraciones en la integridad y la conectividad sináptica. Aquí se proporciona un protocolo detallado para el cultivo de neuronas corticales de rata primaria, tinción faloidina para puntos lagrimales F-actina, y técnicas de cuantificación posteriores. En primer lugar, la corteza frontal de embriones de rata E18 se disocia en cultivo de células de baja densidad, a continuación, las neuronas cultivadas in vitro durante al menos 12-14 días. Después del tratamiento experimental, las neuronas corticales se tiñeron con faloidina AlexaFluor 488 (para etiquetar los puntos lagrimales F-actina dendríticas) y la proteína asociada a microtúbulos 2 (MAP2, para validar las células neuronales y la integridad dendríticas). Finalmente, el software especializado se utiliza para analizar y cuantificar las dendritas neuronales seleccionados al azar. F-actina estructuras ricas están identificados en las ramas dendríticas de segundo orden (rango de longitud y 25-75# 181; m) con inmunofluorescencia MAP2 continua. El protocolo presentado aquí será un método útil para la investigación de cambios en las estructuras de la sinapsis dendríticas posteriores a los tratamientos experimentales.
Introduction
El objetivo principal de este estudio es desarrollar un método fiable de medida (estimación) de la integridad sináptica de la red dendrítica neuronal. A continuación se describe la cuantificación de los puntos lagrimales F-actina en la rata primaria neuronas cultivadas utilizando una combinación de tinción faloidina y detección inmunocitoquímica (CPI) de las dendritas con posterior análisis utilizando software especializado (NIS-Elements).
Falotoxinas etiquetados tienen afinidad similar para los filamentos tanto grandes como pequeñas (F-actina), pero no se unen a la actina monomérica globular (G-actina), a diferencia de algunos anticuerpos de actina 1. La unión no específica de faloidina es despreciable, lo que proporciona el fondo de imagen mínima durante celular. Faloidina es mucho más pequeño que los anticuerpos que normalmente se utilizan para etiquetar proteínas celulares por microscopía de fluorescencia, que permite mucho más intensa etiquetado de F-actina por faloidina. Por lo tanto, a los detalles de la localización de F-actina en neuronas pueden serobtenido mediante el uso de faloidina marcada.
Faloidina (F-actina) tinción de dendritas neuronales discretas genera "puntos calientes" o "puntos lagrimales" brillante, que representan una variedad de estructuras dendríticas maduras, incluyendo las espinas, las sinapsis no espinosas 2 y espinas inmaduras. Espinas inmaduras incluyen filopodios delgadas y algunas formas de la morfología de parches, y pueden representar el inicio de espinogénesis 3. Espinas inmaduras y parches no espinosas carecen PSD95 4. Los cambios en la producción de plomo F-actina a los cambios posteriores en no sólo las espinas dendríticas, sino también estructuras adicionales, con lo que faloidina una herramienta importante para la investigación de la integridad synaptodendritic 5-7. En general, el número de puntos lagrimales faloidina-positivo (F-actina) reflejan un equilibrio entre las sinapsis activas (excitatorias e inhibitorias), la dinámica de actina y la estabilidad sinapsis 8.
Aunque es importante para estudiar t específicaipos de sinapsis (es decir, espinas dorsales excitatorios), cuando se desconoce el objetivo de un tratamiento, es necesario estimar primero la integridad general de una variedad de estructuras dendríticas. Desde F-actina es un componente principal de las espinas dendríticas y otras estructuras, incluyendo las sinapsis inhibidoras, un número alterado de puntos lagrimales F-actina puede indicar un synaptopathy. Este synaptopathy puede entonces investigarse más a fondo de las alteraciones más específicas. Nuestro método de cuantificación para la detección de múltiples tipos / estructuras sinápticas se obtiene una estimación global de las alteraciones sinápticas dendríticas (aumentos y disminuciones) después de varios tratamientos experimentales.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este protocolo, se describe el cultivo de neuronas corticales de rata a baja densidad en placas con fondo de vidrio de 35 mm, que nos permite identificar las dendritas de las neuronas individuales. A continuación, utilizamos faloidina y tinción MAP2 para detectar cambios dendríticas. A continuación, se utilizó un software especializado para cuantificar los cambios en puntos lagrimales F-actina.
Para determinar los cambios en puntos lagrimales F-actina toda la red neuronal de una neur…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by NIH grants DA013137, DA031604, and HD043680. Partial support was provided by a NIH T32 training grant in Biomedical-Behavioral science.
Materials
| 35 mm Glass Bottom Dishes No. 1.5 coverglass | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P9155 | |
| Boric acid | Sigma | B0252 | |
| Borax | Sigma | B9876 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| B-27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080 | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| ProLong Gold | Life Technologies | P36930 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Cover glass | VWR | 631-0137 | |
| AlexaFluor 488 Phalloidin | Life Technologies | A12379 | |
| Normal horse serum | Life Technologies | 26050-070 | |
| Chicken polyclonal anti-MAP2 | abcam | Ab92434 | |
| Alexa Red 594-conjugated goat anti-chicken IgG | Life Technologies | A11042 | |
| NucBlue Live cell stain ReadyProbes Reagent Hoescht 33342 | Life Technologies | R37605 | |
| NIS-Elements software package | Nikon Instruments | ||
| Nikon Eclipse TE2000-E inverted fluorescent computer-controlled microscope | Nikon Instruments | ||
| 0.2 μm Nalgene nylon membrane filter | Fishersci | 151-4020 |
Referenzen
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