Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.
In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.
В естественных изображений обеспечивает прямую визуализацию клеточных поведения в наиболее физиологическом контексте. Прозрачность эмбрионов данио, их быстрого и внешнего развития и богатым набором генетических инструментов , которые позволяют обозначать флуоресцентный все это способствовало более широкое использование микроскопии в естественных условиях для выяснения динамики ключевых событий в области развития. Визуализационные исследования развития нервной системы у данио есть, например , значительно расширили наши знания о поведении нервных клеток – предшественников и судьбы их потомков , включая их последующей миграции, дифференциации и интеграции схем 1-8.
Этап теперь установлен для исследования субклеточных динамики, лежащие в основе этих клеточных поведения. Действительно, данио уже эксплуатируются в качестве инструментов в естественных условиях клеточной биологии. Теперь можно визуализировать митохондрии 9-11, центросомы 2,8,12-14, Гольджи 15, Микротрубочки 4 и актина 16 цитоскелета, Эндосомы 17 и компоненты апикальной мембраны комплекс 1,18, среди других субклеточных структур в данио эмбрионов в естественных условиях. До сих пор большая часть того, что известно о функции этих органелл происходит от изучения их поведения в культуре клеток. В то время как в пробирке исследования дали огромное понимание биологии клетки, клетки в культуре не в полной мере отражают сложность ситуации в естественных условиях и , следовательно , не обязательно отражают функцию и динамику внутриклеточных органелл в естественных условиях. Эмбрионы рыбок данио предлагают жизнеспособной альтернативы в естественных условиях для изучения субклеточных динамики.
Как позвоночных, данио обладают многие системы органов (например, нейронные сетчатки), которые гомологичны тем , которые встречаются у видов млекопитающих. Кроме того, данио эмбрионов все чаще используются для моделирования заболеваний человека 19,20 </sвверх>, в том числе связанные с центросомной функции (например, микроцефалия 21 и врожденного амавроз 22 Лебера) и к митохондриальной функции (например, болезнь Паркинсона 23, тауопатий 10,24 и синдром Барта 25). В естественных условиях формирования изображения на клеточном и субклеточном уровне в этих случаях позволит лучше понять клеточной биологии, лежащей в основе этих патологических состояний.
Общая цель методов , описанных здесь , чтобы обеспечить полное руководство по расследованию органелл и других субклеточных структур в данио эмбрионов с использованием в естественных условиях световой микроскопии. Весь рабочий процесс вовлечены в визуализации и отслеживания субклеточных структур в естественных условиях описывается – от генетических методов маркировки, с целью генерирования скоротечно выражения и стабильной трансгенные рыбы, и , наконец , к визуализации с использованием широкого поля и конфокальной микроскопии. Хотя каждый из этих прокedures используется многочисленными данио лабораторий, протоколы, описанные оптимизированы и упорядочены для исследования динамики субклеточных структур. Два конкретных аспектов работы, описанной здесь, заслуживают упоминания: Во-первых, использование системы экспрессии Gal4-UAS в различных конфигурациях для генетически меток органелл в конкретных типов клеток. Во- вторых, прямое сравнение широкого поля и конфокальной микроскопии для изображения субклеточных структур в естественных условиях.
Современные стратегии в отношении генетически ярлык органелл и других субклеточных структур в данио либо используют мРНК 1,4,8 ограничен или ДНК на основе конструкций , где промоторные элементы непосредственно привод экспрессию слитых белков 9,14,15. В пробирке транскрибируется результаты ограничен РНК в быстрое и широкое выражение, то есть не тканеспецифическая однако. Кроме того, уровни экспрессии уменьшается со временем, поскольку удаляемого РНК разбавляют или деградирует. Таким образом, использование РНК на основеконструирует для изучения динамики органелл на более поздних стадиях развития ограничено (обычно до 3-х дней после оплодотворения).
Эти ограничения могут быть преодолены с помощью ДНК-конструкции, где пространственные и временные контроль экспрессии определяется конкретными элементами промотора. Когда ДНК – конструкции на основе используются в контексте системы Gal4-UAS существенное улучшение уровня экспрессии трансгена наблюдаются 26,27. В этой двудольного системе экспрессии клеток типа конкретных элементов промотора управления экспрессией транскрипционный активатор Gal4, в то время как гены-репортеры, клонируют ниже по потоку от Gal4-связывающего вверх по течению последовательности активационного (БАС). Объединив UAS репортеров с соответствующими драйверами Gal4, выражение может быть ограничено конкретными типов клеток, обходя необходимость клонировать репортерных генов за различными промоторами каждый раз, когда конкретный паттерн экспрессии желателен. Кроме того, экспрессия множественных генов БАС репортер может бытьдвижимый одного Gal4 активатора. Таким образом, система Gal4-UAS обеспечивает универсальный и гибкий генетический подход к внутриклеточной маркировки.
Широкий поля и конфокальной микроскопы являются лошадки большинства лабораторий. Системы Широкопольные обычно используют дуговую лампу в качестве источника света и обнаружить испускаемый свет с чувствительной камеры, которая находится в конце пути света. Этот механизм визуализации, как правило, ограничивается тонких образцов, как вне фокуса света затемняет в фокусе информации в более толстых образцах. Конфокальные микроскопов отличаются от широко полевых систем в том , что они построены в пользу сигналы, исходящие от фокальной плоскости над теми , которые происходят вне фокуса (т.е., "оптический секционирования") 28. Для достижения оптического секционирования обскура помещается на пути излучения в сопряженном положении по отношению к точечного источника света. Лазеры используются в качестве источников света и сигналы детектируются с фотоэлектронных умножителей (ФЭУ). На практике лазерлуч прокатывается по образцу точка за точкой и флуоресцентной эмиссии на каждом месте (пиксель) обнаруживается ФЭУ.
Здесь мы изображение те же субклеточных структур в живых эмбрионов данио использованием как широкого поля и конфокальной микроскопии, чтобы обеспечить прямое сравнение обоих методов микроскопии. Основополагающая цель предоставления таких сравнений, чтобы предложить рекомендации по выбору наиболее подходящего метода микроскопии для конкретного вопроса под рукой.
Используя методы, описанные здесь, мы демонстрируем Gal4-UAS на основе генетической маркировки митохондрий и центросомах. Эти органеллы изображаются в различных клеточных типах нервной системы и в мышечных клетках с помощью широкоугольной и конфокальной микроскопии, чтобы продемонстрировать пригодность каждого метода визуализации. Методы, описанные здесь, могут быть легко адаптированы для исследования других органелл и субклеточных структур в живом данио эмбриона.
Здесь мы демонстрируем универсальность системы экспрессии Gal4-UAS к флуоресцентно митохондрий тегов, центросомах и клеточных мембран специфических типов клеток в естественных условиях в данио эмбрионов. Многие флуоресцентные белки слияния , которые этикетке другие органеллы или ?…
The authors have nothing to disclose.
P.E. is supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Research Training Group 1373 and the Graduate School of the Technische Universität München (TUM-GS). G.P. was supported by TUM-GS. L.T. is supported by an EMBO fellowship (EMBO ALTF 108-2013). D.P.’s work on zebrafish was supported by the DFG through the Sonderforschungsbereich “Molecular Mechanisms of Neurodegeneration” (SFB 596); the Center for Integrated Protein Sciences (Munich) and the European Community’s Seventh Framework Programme (FP7/2007-2013) under Grant agreement no. 200611 (MEMOSAD). He is currently a New York Stem Cell Foundation-Druckenmiller Fellow and was supported by a fellowship from the German Academy of Sciences Leopoldina. L.G. is supported by funding from the DFG through SFB 870 “Assembly and Function of Neuronal Circuits”, Project A11.
We are grateful to Kristina Wullimann for maintaining our fish facility, Yvonne Hufnagel for technical support and Thomas Misgeld for comments on the manuscript. We are grateful to R. Köster (Technische Universität Braunschweig) for providing the M1 Medusa vector (pSKmemmRFP:5xUAS:H2B-CFP:5xUAS:Centrin2-YFP) from which we cloned out Centrin-YFP and S.C. Suzuki and T. Yoshimatsu (University of Washington) for providing the 14xUAS:MA-cerulean cassette which we used to generate the reporter construct to make CentrinFish. We further thank S.C. Suzuki and T. Yoshimatsu (University of Washington) for the Otx2:Gal4 transgenic line, A. Sagasti for the Sensory:Gal4-VP16 construct (UCLA) and M. Nonet (Washington University in St. Louis) for the pCold Heart Tol2 vector. We acknowledge Bettina Schmid, Alexander Hruscha and Christian Haass (German Center for Neurodegenerative Diseases Munich – DZNE) for contributing to the development of MitoFish.
Agarose (2-hydroxyethylagarose) | Sigma-Aldrich | A4018-10G | Low-gelling temperature Type VII |
Block heater | Eppendorf | Thermomixer compact | |
Ca(NO3)2 Calcium nitrate hydrate, 99.996% | Aldrich | 202967-50g | To prepare 30x Danieau's |
CCD camera | Qimaging | Retiga Exi Fast 1394 | |
Ceramic Coated Dumont #5 Forceps | Dumont – Fine Science Tools | 11252-50 | #5 Forceps |
Confocal laser-scanning microscope | Olympus | FV1000 Fluoview | |
Culture dish heater | Warner Instrument Corporation | DH-35 | Heating ring |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfate salt | Fluka Analytical | A5040-100G | Tricaine (anesthetic) |
Fluorescence dissecting microscope | Leica | M205 FA | |
GeneClean kit | MP Biomedicals | 111001200 | |
Glass Bottom Culture Dishes | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | 35mm petri dish, 14mm microwell, No. 0 coverglass |
Glass needles | World Precision Instruments Inc. | TW100F-4 | For microinjections |
HEPES | Sigma | H3375-250g | To prepare 30x Danieau's |
High vacuum grease | Dow Corning | DCC000001242 150g | Silicon dioxide grease |
Incubator | Thermo Scientific | Heraeus | To maintain zebrafish embryos at 28.5⁰ C |
KCl 99% | Sigma-Aldrich | S7643-5kg | To prepare 30x Danieau's |
MgSO4.7H2O Magnesium sulfate heptahydrate 98+% A.C.S reagent | Sigma-Aldrich | 230291-500g | To prepare 30x Danieau's |
Microinjector | Eppendorf | FemtoJet | |
Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | 0.5-20uL |
Micromanipulator | Maerzhaeuser Wetzlar | MM33 Rechts/00-42-101-0000/M3301R | |
Micropipette holder | Intracel | P/N 50-00XX-130-1 | |
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Ambion | AM1340 | To transcribe PCS-Transposase |
NaCl BioXtra >99.5% | Sigma-Aldrich | P9541-1kg | To prepare 30x Danieau's |
Nanophotometer | To measure DNA/RNA concentration | ||
Needle puller | Sutter Instrument | P-1000 | Flaming/Brown |
NIR Apo 40x/0.80W | Nikon | Water-dipping-cone objective | |
N-Phenylthiourea Grade I, approx. 98% | Sigma | P7629-10G | PTU (prevents pigmentation) |
Petri dishes | Sarstedt AG | 821472 | 92 x 16mm |
Plastic molds | Adaptive Science Tools | TU-1 | For microinjections |
Plexiglas cover-with a hole | Custom-made | The hole in the Plexiglas cover should be 3 mm larger than the diameter of the water-dipping-cone objective | |
Tea-strainer (Plastic) | To collect zebrafish eggs | ||
Temperature controller | Warner Instrument Corporation | TC-344B | Dual Automatic Temperature Controller |
Transfer pipettes | Sarstedt AG | 86.1171 | 3.5mL plastic transfer pipettes |
UMPlanFI 100x/1.00W | Olympus | Water-dipping-cone objective | |
UMPlanFLN 20x/0.50W | Olympus | Water-dipping-cone objective | |
Widefield microscope | Olympus | BX51WI | |
PTU (50x Stock) | Dissolve 76 mg PTU in 50 ml distilled water Stir vigorously at room temperature Store at -20 oC in 1 ml aliquots Use at 1x working solution |
||
Tricaine (20x Stock) | Dissolve 200 mg Tricaine in 48 ml distilled water Add 2 ml 1M Tris base (pH9) Adjust to pH 7 Store at -20 oC in 1 ml aliquots Use at 1x working solution |
||
Danieau's Solution (30x Stock) | 1740 mM NaCl <21 mM KCl 12 mM MgSO4.7H2O 18 mM Ca (NO3)2 150 mM HEPES buffer Distilled water upto 1 L Store at 4 oC Use at 0.3x working solution |