Bitkisel Hücreler Hedefli lizis ile Çevre Örneklerden endosporlar Fiziksel İzolasyonu
Summary
A method to single out bacterial endospores from complex microbial communities was developed to perform tailored culture or molecular studies of this group of bacteria.
Abstract
Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a morpho-physiological resting state that enhances survival under adverse environmental conditions. Even though endospore-forming Firmicutes are one of the most frequently enriched and isolated bacterial groups in culturing studies, they are often absent from diversity studies based on molecular methods. The resistance of the spore core is considered one of the factors limiting the recovery of DNA from endospores. We developed a method that takes advantage of the higher resistance of endospores to separate them from other cells in a complex microbial community using physical, enzymatic and chemical lysis methods. The endospore-only preparation thus obtained can be used for re-culturing or to perform downstream analysis such as tailored DNA extraction optimized for endospores and subsequent DNA sequencing. This method, applied to sediment samples, has allowed the enrichment of endospores and after sequencing, has revealed a large diversity of endospore-formers in freshwater lake sediments. We expect that the application of this method to other samples will yield a similar outcome.
Introduction
Bu çalışmanın amacı, çevre numuneleri içinde vejetatif bakteriyel hücrelerden bakteri sporları ayrılması için bir protokol sağlamaktır. Bakteri sporları oluşumu filum Firmicutes 1 ait olan bakteri grupları bir dizi bulunan bir hayatta kalma stratejisi genellikle açlık tetiklediği vardır. Endospore oluşturan bakteriler de suşları bir dizi patojenleri ve dolayısıyla tıbbi önemi (örneğin, Bacillus anthracis veya Clostridium difficile) vardır başlıca nedeni, incelenmiştir. Endospore oluşturan bakterilerin Çevre suşları hemen hemen her ortamda (toprak, su, sediment, hava, buz, insan bağırsak, hayvanlar gut, ve daha fazla) 1-3 izole edilmiştir. Bu nedenle, Firmicutes kültür koleksiyonları 4 ikinci en bol filum vardır.
Çünkü onların cesur dış korteks ve koruyucu çekirdek proteinlerinin, endosporlar fr değişen aşırı çevre koşulları yaşayabiliryüksek radyasyon, aşırı sıcaklıklara ve zararlı kimyasallar 5 om kuruma. Bu olağanüstü direnci endosporlar 6-8 DNA ayıklamak için bir meydan okuma yapar. Çevresel sıralama çalışmalarında 9,10 gözardı edilmiş bu yüzden muhtemelen açıklıyor. Floresan antikorlar 11 ile çevre numuneleri içinde endosporlar hedeflenmesi gibi diğer yöntemler, toprak 12 ve tortu 13 dipikolinik asit ölçümü (DPA), 14 akış sitometrisi veya pastörizasyon ve daha sonra kültür 15,16 endosporlar almak veya ölçmek için kullanılmıştır Çevresel örnekleri. Son yıllarda, optimize edilmiş DNA ekstraksiyon yöntemleri yanı sıra, spesifik moleküler primerler endospor-özgü gen sekansları, 10,17-20 geliştirilmiştir hedef. Bu bakteriler 21 bu grup arasında daha biyolojik çeşitlilik ortaya çıkarmak için yardımcı olan ve aynı zamanda endosporlar tespiti için endüstride ve tıpta uygulamalara yol açmıştırSüt tozu 19, örneğin.
Burada sunulan protokol hücreleri vejetatif göre bakteri sporları arasında (örneğin, ısı ve deterjanlar gibi), zararlı fizikokimyasal koşullara direnç farka dayanır. Bir numunede vejetatif hücrelerini yok etmek için, biz arka arkaya ısı, lizozim ve deterjan düşük konsantrasyonlarda geçerlidir. Sporlar yok etmek ama tüm vejetatif hücreleri lize etmek için değil, böylece bu tedavilerin zaman ve güç optimize edilmiştir. Bir çevre hücre havuzu bazı hücreler diğerlerinden daha dayanıklıdır, böylece tüm vejetatif hücrelerin tahrip olasılığını artırmak amacıyla, üç farklı tedaviler uygulanır. Bu yöntemin avantajı, ve yenilik tedaviden sonra endosporlar hala sağlam ve daha fazla alt analizler için kullanılabilir olmasıdır. Bunlar d azaltılması ve böylece DNA ekstraksiyon, kantitatif PCR (qPCR) ve amplikon veya özel endosporlar grubu hedef alan metagenomic dizileme (ve dahilÇeflitlilik) kapsama artırırken. Endosporlar de mansap yetiştirme veya floresan mikroskobu ile miktar tayini için kullanılabilir, akış sitometrisi veya DPA tespiti. Bu yöntemin önemli bir özelliği, tedavi edilen bir örnek ile işlem görmemiş bir numune ile karşılaştırılması, tek bir hücre vejetatif karşılık gelen bileşene ek olarak bir çevre numunede endosporlar miktar ve çeşitliliği anlamak olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dış agresif fizikokimyasal faktörlerden (örneğin, sıcaklık ya da deterjanlar) ile endosporlar direnci çevre örneklerinde bitkisel hücrelerden bakteri endosporlar ayırmak için bir yöntem bulmak için kullanıldı. Bu bir tahribatsız şekilde çevresel örneklerden izole endosporlar ilk kapsamlı yöntemdir. Ölçmek algılamak veya numunelerde endosporlar analiz etmek için önceki metotlar, dipikolinik asit veya spesifik bir işaretleyici genler gibi endosporlar özel vekiller ölçümüne dayanma…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Bağış No. 31003A-132358/1, 31003A_152972 ve sayılı 151948 İsviçre Ulusal Bilim Vakfı kabul ve Fundation Pierre Mercier la Science dökün.
Materials
| Whatman nitrocellulose membrane filters, 0,2 um pore size, 47 mm diameter | Sigma-Aldrich | WHA7182004 Aldrich | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 Sigma-Aldrich | CAS 77-86-1 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 Sigma-Aldrich | CAS 60-00-4 |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | 62971 Fluka | powder, CAS 12650-88-3 |
| Ultra-Turrax homogenizer T18 basic | IKA | 3720000 | |
| Glass filter holders for 47 mm membranes, pyrex glass | EMD Millipore | XX10 047 00 | |
| Chemical duty vacuum pump | Millipore | WP6122050 | 220 V/50 Hz |
| Manifold sampling filtration for 25 mm membranes | Millipore | 1225 Sampling Manifold | polypropylene |
| Dnase | New England Biolabs | M0303S | Rnase free |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 Sigma-Aldrich | CAS 1310-73-2 |
| Sodium dodecyl sulfphate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 Sigma | |
| Whatman nitrocellulose membrane filters, 0,2 um pore size, 25 mm diameter | Sigma-Aldrich | WHA7182002 Aldrich | |
Referenzen
- Nicholson, W. L. Roles of Bacillus endospores in the environment. Cell Mol Life Sci. 59 (3), 410-416 (2002).
- Lester, E. D., Satomi, M., Ponce, A. Microflora of extreme arid Atacama Desert soils. Soil Biol Biochem. 39 (2), 704-708 (2007).
- Wilson, M. S., Siering, P. L., White, C. L., Hauser, M. E., Bartles, A. N. Novel archaea and bacteria dominate stable microbial communities in North America’s Largest Hot Spring. Microb Ecol. 56 (2), 292-305 (2008).
- Hugenholtz, P. Exploring prokaryotic diversity in the genomic era. Genome Biol. 3 (2), (2002).
- Onyenwoke, R. U., Brill, J. A., Farahi, K., Wiegel, J. Sporulation genes in members of the low G+C Gram-type-positive phylogenetic branch (Firmicutes). Arch Microbiol. 182 (2-3), 182-192 (2004).
- Delmont, T. O., et al. Accessing the soil metagenome for studies of microbial diversity. Appl Environ Microbiol. 77 (4), 1315-1324 (2011).
- Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. . Bacterial spore formers: probiotics and emerging applications. , (2004).
- Kuske, C. R., et al. Small-Scale DNA Sample Preparation Method for Field PCR Detection of Microbial Cells and Spores in Soil. Appl Environ Microbiol. 64 (7), 2463-2472 (1998).
- von Mering, C., et al. Quantitative phylogenetic assessment of microbial communities in diverse environments. Science. 315 (8515), 1126-1130 (2007).
- Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. Stage 0 sporulation gene A as a molecular marker to study diversity of endospore-forming Firmicutes. Environ Microbiol Rep. 5 (6), 911-924 (2013).
- Siala, A., Hill, I. R., Gray, T. R. G. Populations of spore-forming bacteria in an acid forest soil, with special reference to Bacillus subtilis. J General Microbiol. 81 (1), 183-190 (1974).
- Brandes Ammann, A., Kolle, L., Brandl, H. Detection of bacterial endospores in soil by terbium fluorescence. Int J Microbiol. , 435281 (2011).
- Fichtel, J., Koster, J., Rullkotter, J., Saas, H. High variations in endospore numbers within tidal flat sediments revealed by quantification of dipicolinic acid. Geomicrobiol J. 25 (7-8), (2008).
- Cronin, U. P., Wilkinson, M. G. The potential of flow cytometry in the study of Bacillus cereus. J Appl Microbiol. 108 (1), 1-16 (2010).
- de Rezende, J. R., et al. Dispersal of thermophilic Desulfotomaculum endospores into Baltic Sea sediments over thousands of years. ISME J. 7 (1), 72-84 (2013).
- Hubert, C., et al. Thermophilic anaerobes in Arctic marine sediments induced to mineralize complex organic matter at high temperature. Environ Microbiol. 12 (4), 1089-1104 (2010).
- Garbeva, P., van Veen, J. A., van Elsas, J. D. Predominant Bacillus spp. in agricultural soil under different management regimes detected via PCR-DGGE. Microb Ecol. 45 (3), 302-316 (2003).
- Brill, J. A., Wiegel, J. Differentiation between spore-forming and asporogenic bacteria using a PCR and southern hybridization based method. J Microbiol Methods. 31 (1-2), 29-36 (1997).
- Rueckert, A., Ronimus, R. S., Morgan, H. W. Development of a real-time PCR assay targeting the sporulation gene, spo0A., for the enumeration of thermophilic bacilli in milk powder. Food Microbiol. 23 (3), 220-230 (2006).
- Bueche, M., et al. Quantification of endospore-forming firmicutes by quantitative PCR with the functional gene spo0A. Appl Environ Microbiol. 79 (17), 5302-5312 (2013).
- Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. Endospore-enriched sequencing approach reveals unprecedented diversity of Firmicutes in sediments. Environ Microbiol Rep. 6 (6), 631-639 (2014).
- Nicholson, W. L., Law, J. F. Method for purification of bacterial endospores from soils: UV resistance of natural Sonoran desert soil populations of Bacillus spp. with reference to B. subtilis strain 168. J Microbiol Methods. 35 (1), 13-21 (1999).
