Une cellule endothéliale Planar Modèle for Imaging Dynamics Synapse immunologique

Les lymphocytes T sont une branche du système immunitaire adaptatif caractérisé par la capacité de reconnaître efficacement antigène peptidique (Ag) lié à complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) à travers leurs récepteurs de lymphocytes T ^(TCR) 1. Lymphocytes naïfs migrent constitutivement et Scan 'Ag cellules présentatrices professionnels »(CPA; par exemple, les cellules dendritiques) dans les ganglions lymphatiques, tandis que les cellules mémoire / T effecteurs doivent pouvoir surveiller efficacement une gamme extrêmement large d'APC et les cellules cibles potentielles dans les tissus périphériques.

Dans le min après la comptabilisation initiale de l'apparenté Ag sur une APC, les lymphocytes arrêter leur migration et de commencer à former intime une interface spécialisée cellule-cellule appelée "synapse immunologique" (IS). Soutenue (c.-à 30-60 min) EST contacts sont nécessaires pour amplifier et soutenir signalisation ^2-7. Nouvelles études identifient que dans le SI, il est la formation continue et r rapideemodeling de signalisation sous-cellulaire des micro-amas discrets (par exemple, contenant du CMH / Ag-TCR, la F-actine, l'adhérence et des molécules de signalisation) qui déterminent la résistance et la qualité de la réponse immunitaire résultante ^2-7. Cependant, les détails dynamiques et mécanisme de régulation de ce processus sont encore mal compris ^8,9. Cette situation découle en grande partie des défis techniques liés aux topologies de surfaces irrégulières APC et l'orientation mal contrôlée des plans d'interaction cellule-cellule, les problèmes qui limitent profondément l'imagerie spatio-temporelle requise approches ^8-10 (Figure1A).

Figure 1. Un physiologique Planar cellulaire APC Modèle pour l'imagerie immunologique Synapse Dynamics. Le schéma illustre l'imagerie traditionnelle de la synapse immunologique entre un lymphocyte T et un professio APC nal (A) et des cellules T et un modèle traditionnel plane lipidique bicouche APC (B) par rapport à ce nouveau modèle plane APC endotheliales (C). APC professionnelles fournissent des synapses immunologiques physiologiques, mais offrent l'interface mal orienté cellule-cellule (par exemple, par rapport au plan optimal de formation d'image xy, la résolution ~ 0,2 pm), ce qui compromet considérablement spatial (z imagerie avion résolution ~ 1 um) et temporelle (par exemple, en raison de la nécessité de numériser plusieurs reprises à travers tous les plans z d'imagerie) résolution de l'imagerie. Modèles bicouches ont une topologie planaire qui fournit une résolution spatio-temporelle optimale d'imagerie, mais sont également très simplifiées, non physiologique et rigide. Ce modèle associe des cellules endotheliales de la topologie du plan de bicouches lipidiques avec le substrat physiologique d'un APC classique pour fournir la résolution de l'imagerie spatiale et temporelle optimale dans un contexte physiologique.m / files / ftp_upload / 53288 / 53288fig1large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Des travaux antérieurs ont partiellement contourné ces obstacles en élaborant des modèles de substrat plan (c.-à-bicouches lipidiques et des surfaces revêtues d'anticorps) qui fournissent la résolution spatio-temporelle optimale (ie, par l'intermédiaire de la fixation de la surface de l'activation des cellules T dans un plan unique qui est parallèle à l'imagerie xy optimale plan) ^{11 à 15} (figure 1B). Ces modèles ont facilité des informations importantes sur la dynamique sous-cellulaires / moléculaires qui contrôlent la signalisation antigénique des lymphocytes T, y compris la découverte d'actine dynamique / TCR de signalisation micro-clusters ^7,11-14. Toutefois, ces modèles sont intrinsèquement trop simplifiées, ainsi que rigide (excluant le développement / étude des caractéristiques topologiques 3 dimensions) (figure 1B). Par conséquent, il reste incertain comment relier ces résultats à PHYcellule-cellule siologic de la surveillance immunitaire.

Bien que toujours sous-étudié, vasculaire et les cellules endothéliales lymphatiques apparaissent comme un grand (ie, plus nombreux que tous les APC professionnelles, par ~ 1000 fois) compartiment périphérique de «semi-professionnel» APC ^16-18. Ces cellules expriment MHC-I, MHC-II et une multitude de molécules co-stimulatrices (par exemple, CD40, LFA3, ICOSL, 4-1BB, OX40L, TL1A, PD-L1; mais pas CD80 et CD86) et sont stratégiquement positionné à l'interface sang-tissus où ils remplissent des fonctions sentinelles spécialisées ^16-18. Des études antérieures ont démontré que les cellules endothéliales peuvent effectivement re-stimuler effecteur / mémoire, mais pas naïfs, les cellules T ^19-25. Ainsi, les cellules endotheliales sont susceptibles de jouer un rôle unique APC en phase effectrice de la réponse immunitaire adaptative dans les tissus périphériques, tels que l'influence locale sur activation des lymphocytes T, la différenciation, de la mémoire et de la tolérance ^16,17,26. Critiquement, lorsqu'elles sont cultivées in vitro, les cellules endotheliales forment des surfaces planes pratiquement cellulaires et sont facilement transfectables (par exemple, avec les reporters de protéines fluorescentes). Ces caractéristiques sont idéales pour la résolution spatio-temporelle de haute imagerie de la dynamique topologiques au cours des interactions cellule-cellule ^19,27. Ainsi, les cellules endothéliales pourraient servir de «cellulaire plane APC« modèle physiologique distinctement adapté pour l'étude des mécanismes de remodelage sous-cellulaires / moléculaires qui conduisent reconnaissance de l'antigène et régulent les réponses (figure 1C) ^19,20.

Auparavant établi des techniques d'imagerie complémentaires (y compris la transfection de cellules endotheliales avec une machine de protéines fluorescentes de la membrane plasmique et cytosol) pour étudier les détails de l'interaction des leucocytes-endothélial au cours de l'adhérence et de la migration transendotheliale ^27, ont montré que les leucocytes sonde active la surface de l'endothélium par dynamique l'insertion d'und rétraction de sous-échelle du micron, protubérances cylindriques actine riche (~ 200-1,000 nm de diamètre et de profondeur) appelé invadosome-comme des saillies (ie, "PAI") ^27,28. Ces approches d'imagerie ont été encore élargi avec la création de protocoles de profiter de la fonction endothéliale APC pour développer les premières méthodes de résolution spatio-temporelle de l'imagerie haute cellule T-endothélial synapse immunologique comme rapporté ^19,20 et décrire plus en détail ici. Une conclusion centrale dérivé de ce roman plane cellulaire modèle APC est que PAI de cellules T fonctionnent à la fois dans la promotion de la détection initiale Ag et dans le maintien de la signalisation subséquente. En effet, les tableaux de multiples PAI (qui ont été stabilisés et comptabilisée en réponse à parapher le flux de calcium) montrent un enrichissement en molécules TCR et suggestives de la signalisation actif tel PKC-Q, ZAP-70, phosphotyrosine et HS1. Par conséquent, PAI semblent représenter une tridimensionnel équivalent physiologique de la micro-TCR de signalisationgrappes observés dans les modèles à deux couches planes. Cette approche, donc, révèle sensible / rapports dynamique moléculaire et architecturaux (et implicites biomécanique) pas autrement détectable.

La méthode décrite ici devrait être utile à combler le fossé entre les APC professionnelle et modèles artificiels de substrat APC afin d'améliorer notre capacité d'interroger les mécanismes de base de réponses immunitaires adaptatives. Alors que l'accent est mis ici sur l'activation de CD4 ⁺ de type Th1 effecteur / cellule de mémoire, cette approche de base peut être facilement modifié pour étudier un large éventail de types et de Ags de cellules T, comme on le verra ci-dessous.