This manuscript provides a step-by-step procedure for the derivation and maintenance of human keratinocytes from plucked hair and subsequent generation of integration-free human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) by episomal vectors.
Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using patient-specific hiPSCs allows the study of the underlying mechanism for pathogenesis, also providing a platform for the development of in vitro drug screening and gene therapy to improve treatment options. The promising potential of hiPSCs for regenerative medicine is also evident from the increasing number of publications (>7000) on iPSCs in recent years. Various cell types from distinct lineages have been successfully used for hiPSC generation, including skin fibroblasts, hematopoietic cells and epidermal keratinocytes. While skin biopsies and blood collection are routinely performed in many labs as a source of somatic cells for the generation of hiPSCs, the collection and subsequent derivation of hair keratinocytes are less commonly used. Hair-derived keratinocytes represent a non-invasive approach to obtain cell samples from patients. Here we outline a simple non-invasive method for the derivation of keratinocytes from plucked hair. We also provide instructions for maintenance of keratinocytes and subsequent reprogramming to generate integration-free hiPSC using episomal vectors.
Oppdagelsen av menneskeskapte pluripotent stamceller (hiPSCs) har revolusjonert innen regenerativ medisin, og gir en mulig metode for generering av pasientspesifikke stamceller 1-3. hiPSCs har blitt generert fra ulike somatiske celletyper, inkludert fibroblaster 4,5, hematopoetiske celler 6,7, nyre epitelceller fra urin 8 og keratinocytter 9,10. Til dags dato, hudfibroblaster og blodkreft cellene representerer de mest brukte celle kilder for å generere pasientspesifikke iPSCs. Uten tvil, dette er på grunn av det faktum at huden biopsier og blodprøvetaking er rutinemessige medisinske prosedyrer og store biobanker av pasientens blod eller hud prøver har blitt etablert i mange land.
I motsetning til blodceller og hud-fibroblast som krever invasive ekstraksjonsmetoder, keratinocytter representerer en lett tilgjengelig celletype for hiPSC generasjon. Keratinocytes er keratin-rik epitelceller som danner den ytre epidermal barriere på huden, og er også funnet i negler og hår 11. Spesielt kan keratinocytter finnes på den ytre rot skjede (ORS) av hårsekkene, et ytre cellelag som dekket håret sammen med den indre rot skjede (IRS) celler (12, figur 1). Som håret kolleksjonen er en enkel prosedyre som ikke krever hjelp fra medisinsk personell, gir det en mulighet for pasienter å samle inn og sende sine egne hårprøver til laboratorier, som i stor grad vil lette innsamling av prøver for hiPSC generasjon. Epidermale keratinocytter har også en høyere effektivitet og omprogrammering raskere reprogrammerings-kinetikk i forhold til fibroblaster, og legger til fordelene ved å bruke keratinocytter som utgangsceller for hiPSC generering 9,13. Videre kan hiPSCs også genereres ved å bruke andre cellepopulasjoner i hårsekken,inkludert dermal papilla celler lokalisert i bunnen av hårsekken 14,15.
Tidligere rapporter om IPSC generasjon som bruker hair-deriverte celler utnytter ofte retrovirale eller lentiviral baserte omprogrammering metoder 9,14,15. Men disse virale metoder innføre uønsket genomisk integrering av utenlandske transgener under omprogrammering. Til sammenligning bruk av episomale vektorer som representerer en mulig, ikke-viral omprogrammering metode for å generere integrasjonsfrie iPSCs 4. Vi har tidligere utviklet en enkel, kostnadseffektiv og ikke-viral metode for å effektivt omprogrammere keratinocyte inn hiPSCs bruker episomale vektorer 13. Her har vi gi en detaljert protokoll for generering av keratinocytt-avledet hiPSCs, herunder avledning av keratinocytter fra plukket hår, utvidelse og vedlikehold av keratinocytter og påfølgende omprogrammering for å generere hiPSCs.
Generering av pasientspesifikke hiPSCs tilbyr en unik tilnærming for å studere patogenesen i syke celletyper in vitro, og gir også en plattform for narkotika-screening for å identifisere nye molekyler som kan redde sykdommen fenotyper. Denne sykdommen modellering tilnærming ved hjelp hiPSCs har gitt lovende resultater for en rekke sykdommer, blant annet Long QT-syndrom, Huntingtons sykdom, Parkinsons sykdom og amyotrofisk lateral sklerose 22. Flere tiltak er allerede i gang med å etablere store…
The authors have nothing to disclose.
The authors wish to thank Harene Ranjithakumaran and Stacey Jackson for technical support. This work was supported in part by grants from the National Health and Medical Research Council (R.C.B. Wong, A. Pébay), the University of Melbourne (R.C.B. Wong), Retina Australia (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung, A. Pébay) and the Ophthalmic Research Institute of Australia (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung, A. Pébay); Australian Research Council Future Fellowship (A. Pébay, FT140100047), Cranbourne Foundation Fellowship (R.C.B. Wong); intramural funding from the National Institutes for Health (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung) and operational infrastructure support from the Victorian Government.
Antibiotic Mix: | |||
250 ng/ml Antimycotic amphotericin B | Sigma | A2942-20ml | Antibiotic mix is made up in PBS. |
1X Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
PBS (-) | Invitrogen | 14190-144 | |
Knockout Serum Replacement (KSR) medium: | KSR medium is filtered using Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) before use. bFGF is added fresh to the media before use. | ||
20% knockout serum replacement (KSR) | Invitrogen | 10828-028 | |
DMEM/F12 with glutamax | Invitrogen | 10565-042 | |
1× MEM non-essential amino acid | Invitrogen | 11140-050 | |
0.5× Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
0.1 mM β-mercaptoethanol | Invitrogen | 21985 | |
bFGF (10 ng/ml, added fresh) | Millipore | GF003 | |
Keratinocyte medium: | |||
EpiLife with 60 µM Calcium | Invitrogen | M-EPI-500-CA | |
1× Human keratinocyte growth supplement (HKGS) | Invitrogen | S-001-5 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) medium: | FBS medium is filtered using Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) before use. | ||
10% fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 26140079 | |
DMEM | Invitrogen | 11995-073 | |
0.5× Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
2 mM L-glutamine | Invitrogen | 25030 | |
0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
Extracellular Matrix (ECM): | |||
Matrigel | Corning | 354234 | Aliquot Matrigel stock and store in -80°C following manufacturer’s instructions. Stock concentration of Matrigel varies slightly from batch to batch (~9mg/ml). We recommend to use 200µl matrigel for coating a 12-well plate (~150µg/well). |
Coating Matrix Kit | Invitrogen | R-011-K | |
Plasmids: | Note that pCXLE-eGFP is only used for monitoring transfection efficiency and is not required for reprogramming. | ||
- pCXLE-eGFP | Addgene | 27082 | |
- pCXLE-hOct3/4-shP53F | Addgene | 27077 | |
- pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | |
- pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | |
Transfection reagent Fugene HD | Promega | E231B | |
Gelatin (from porcine skin) | Sigma | G1890 | Make up 0.1% gelatin in distilled water. Autoclave before use. |
Reduced Serum medium: OPTI-MEM | Invitrogen | 31985062 | |
Accutase | Sigma | A6964-100ml | |
Mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder | MEF can be inactivated by mitomycin C treatment or irradiation as described previously 16. | ||
26G needle | Terumo | NN2613R | |
6-well plate (tissue culture treated) | BD Biosciences | 353046 | |
12-well plate (tissue culture treated) | BD Biosciences | 353043 | |
10 cm dish (tissue culture treated) | BD Biosciences | 353003 | |
Dispase | Invitrogen | 17105-041 | Use at 10mg/ml |
Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | Use at 1mg/ml |
TRA-160 antibody | Millipore | MAB4360 | Use at 5µg/ml |
OCT4 antibody | Santa Cruz | SC-5279 | Use at 5µg/ml |
NANOG antibody | R&D Systems | AF1997 | Use at 10µg/ml |
MycoAlert Detection kit | Lonza | LT07-418 |