جيل من التكامل خالية الإنسان المستحثة متعددة القدرات الخلايا الجذعية عن طريق الشعر المستمدة من الخلايا الكيراتينية
Summary
This manuscript provides a step-by-step procedure for the derivation and maintenance of human keratinocytes from plucked hair and subsequent generation of integration-free human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) by episomal vectors.
Abstract
Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using patient-specific hiPSCs allows the study of the underlying mechanism for pathogenesis, also providing a platform for the development of in vitro drug screening and gene therapy to improve treatment options. The promising potential of hiPSCs for regenerative medicine is also evident from the increasing number of publications (>7000) on iPSCs in recent years. Various cell types from distinct lineages have been successfully used for hiPSC generation, including skin fibroblasts, hematopoietic cells and epidermal keratinocytes. While skin biopsies and blood collection are routinely performed in many labs as a source of somatic cells for the generation of hiPSCs, the collection and subsequent derivation of hair keratinocytes are less commonly used. Hair-derived keratinocytes represent a non-invasive approach to obtain cell samples from patients. Here we outline a simple non-invasive method for the derivation of keratinocytes from plucked hair. We also provide instructions for maintenance of keratinocytes and subsequent reprogramming to generate integration-free hiPSC using episomal vectors.
Introduction
اكتشاف الناجمة عن النشاط البشري الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSCs) قد أحدثت ثورة في مجال الطب التجديدي، وتوفير وسيلة عملية لتوليد الخلايا الجذعية المريض محددة 1-3. وقد ولدت hiPSCs بنجاح من مختلف أنواع الخلايا الجسدية، بما في ذلك الخلايا الليفية 4،5، 6،7 الخلايا المكونة للدم والخلايا الظهارية الكلوية من البول (8) والخلايا الكيراتينية 9،10. حتى الآن، الخلايا الليفية الجلد والخلايا المكونة للدم تمثل مصادر الخلايا الأكثر استخداما لتوليد iPSCs المريض محددة. يمكن القول، ويرجع ذلك إلى حقيقة أن خزعات الجلد وجمع الدم هي الإجراءات الطبية الروتينية والمصارف البيولوجية كبيرة من المرضى عينات الدم أو الجلد وأنشئت في كثير من البلدان هذه.
وعلى النقيض من خلايا الدم والخلايا الليفية الجلدية التي تتطلب أساليب الاستخراج الغازية، الكيراتينية تمثل نوع من الخلايا يمكن الوصول إليه بسهولة لتوليد hiPSC. Keratinocytوفاق هي خلايا الكيراتين الغنية الظهارية التي تشكل حاجز البشرة الخارجية للجلد وتوجد أيضا في الأظافر والشعر 11. على وجه الخصوص، الكيراتينية ويمكن الاطلاع على غمد الجذر الخارجي (ORS) من بصيلات الشعر، وهي طبقة الخلايا الخارجية التي يغطيها جذع الشعرة مع غمد الجذر الداخلية (IRS) خلايا (12، الشكل 1). كما جمع الشعر هو إجراء بسيط لا يتطلب المساعدة من العاملين في المجال الطبي، فإنه يوفر فرصة للمرضى لجمع وإرسال عينات من الشعر الخاصة للمختبرات، والتي من شأنها أن تسهل إلى حد كبير جمع عينات من المرضى لتوليد hiPSC. يكون الكيراتينية البشرة أيضا أعلى كفاءة إعادة برمجة وحركية إعادة برمجة أسرع مقارنة مع الخلايا الليفية، إضافة إلى مزايا استخدام الخلايا الكيراتينية كما الخلايا تبدأ لتوليد hiPSC 9،13. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا أن تتولد hiPSCs استخدام السكان الخلية الآخرين داخل بصيلات الشعر،بما في ذلك خلايا الجلد حليمة التي تقع في قاعدة 14،15 بصيلات الشعر.
التقارير السابقة للجيل التوجيهية باستخدام الخلايا المشتقة من الشعر غالبا ما تستخدم أساليب برمجة فيروسات أو القائم على lentiviral 9،14،15. ومع ذلك، وهذه الأساليب الفيروسية إدخال التكامل الجيني غير مرغوب فيه من الجينات المحورة الخارجية خلال إعادة برمجة. في المقارنة، واستخدام ناقلات episomal يمثل ممكنا، طريقة إعادة برمجة غير الفيروسي لتوليد iPSCs خالية من التكامل 4. لقد سبق وضعت لذلك، طريقة بسيطة فعالة من حيث التكلفة وغير فيروسية لإعادة برمجة الخلايا الكيراتينية في hiPSCs باستخدام ناقلات episomal 13 بكفاءة. نحن هنا نقدم بروتوكول مفصل لتوليد hiPSCs المستمدة من الخلايا الكيراتينية، بما في ذلك اشتقاق الخلايا الكيراتينية من التقطه الشعر، وتوسيع وصيانة الخلايا الكيراتينية وإعادة برمجة لاحقة لتوليد hiPSCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
جيل من hiPSCs المريض محددة يقدم نهجا فريدا لدراسة المرضية في أنواع الخلايا المريضة في المختبر، ويوفر أيضا منصة لفحص المخدرات للتعرف على الجزيئات الجديدة التي يمكن انقاذ الظواهر المرض. هذا النهج النمذجة المرض باستخدام hiPSCs قد حقق نتائج واعدة لمجموعة متنوعة من الأمر…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors wish to thank Harene Ranjithakumaran and Stacey Jackson for technical support. This work was supported in part by grants from the National Health and Medical Research Council (R.C.B. Wong, A. Pébay), the University of Melbourne (R.C.B. Wong), Retina Australia (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung, A. Pébay) and the Ophthalmic Research Institute of Australia (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung, A. Pébay); Australian Research Council Future Fellowship (A. Pébay, FT140100047), Cranbourne Foundation Fellowship (R.C.B. Wong); intramural funding from the National Institutes for Health (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung) and operational infrastructure support from the Victorian Government.
Materials
| Antibiotic Mix: | |||
| 250 ng/ml Antimycotic amphotericin B | Sigma | A2942-20ml | Antibiotic mix is made up in PBS. |
| 1X Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| PBS (-) | Invitrogen | 14190-144 | |
| Knockout Serum Replacement (KSR) medium: | KSR medium is filtered using Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) before use. bFGF is added fresh to the media before use. | ||
| 20% knockout serum replacement (KSR) | Invitrogen | 10828-028 | |
| DMEM/F12 with glutamax | Invitrogen | 10565-042 | |
| 1× MEM non-essential amino acid | Invitrogen | 11140-050 | |
| 0.5× Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| 0.1 mM β-mercaptoethanol | Invitrogen | 21985 | |
| bFGF (10 ng/ml, added fresh) | Millipore | GF003 | |
| Keratinocyte medium: | |||
| EpiLife with 60 µM Calcium | Invitrogen | M-EPI-500-CA | |
| 1× Human keratinocyte growth supplement (HKGS) | Invitrogen | S-001-5 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) medium: | FBS medium is filtered using Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) before use. | ||
| 10% fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 26140079 | |
| DMEM | Invitrogen | 11995-073 | |
| 0.5× Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| 2 mM L-glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
| Extracellular Matrix (ECM): | |||
| Matrigel | Corning | 354234 | Aliquot Matrigel stock and store in -80°C following manufacturer’s instructions. Stock concentration of Matrigel varies slightly from batch to batch (~9mg/ml). We recommend to use 200µl matrigel for coating a 12-well plate (~150µg/well). |
| Coating Matrix Kit | Invitrogen | R-011-K | |
| Plasmids: | Note that pCXLE-eGFP is only used for monitoring transfection efficiency and is not required for reprogramming. | ||
| - pCXLE-eGFP | Addgene | 27082 | |
| - pCXLE-hOct3/4-shP53F | Addgene | 27077 | |
| - pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | |
| - pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | |
| Transfection reagent Fugene HD | Promega | E231B | |
| Gelatin (from porcine skin) | Sigma | G1890 | Make up 0.1% gelatin in distilled water. Autoclave before use. |
| Reduced Serum medium: OPTI-MEM | Invitrogen | 31985062 | |
| Accutase | Sigma | A6964-100ml | |
| Mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder | MEF can be inactivated by mitomycin C treatment or irradiation as described previously 16. | ||
| 26G needle | Terumo | NN2613R | |
| 6-well plate (tissue culture treated) | BD Biosciences | 353046 | |
| 12-well plate (tissue culture treated) | BD Biosciences | 353043 | |
| 10 cm dish (tissue culture treated) | BD Biosciences | 353003 | |
| Dispase | Invitrogen | 17105-041 | Use at 10mg/ml |
| Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | Use at 1mg/ml |
| TRA-160 antibody | Millipore | MAB4360 | Use at 5µg/ml |
| OCT4 antibody | Santa Cruz | SC-5279 | Use at 5µg/ml |
| NANOG antibody | R&D Systems | AF1997 | Use at 10µg/ml |
| MycoAlert Detection kit | Lonza | LT07-418 |
Referenzen
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat Methods. 8, 409-412 (2011).
- Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, U141-U141 (2008).
- Okita, K., et al. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 31, 458-466 (2013).
- Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nat Protoc. 7, 2013-2021 (2012).
- Zhou, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from urine. J Am Soc Nephrol. 22, 1221-1228 (2011).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).
- Peters, A., Zambidis, E., Ye, K., Jin, S. Chapter 16. Generation of nonviral integration-free induced pluripotent stem cells from plucked human hair follicles. Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells: Lineage-Specific Differentiation Protocols.Springer Protocols Handbooks. , 203-227 (2012).
- Fuchs, E. Scratching the surface of skin development. Nature. 445, 834-842 (2007).
- Limat, A., Noser, F. K. Serial cultivation of single keratinocytes from the outer root sheath of human scalp hair follicles. J Invest Dermatol. 87, 485-488 (1986).
- Piao, Y., Hung, S. S., Lim, S. Y., Wong, R. C., Ko, M. S. Efficient generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from keratinocytes by simple transfection of episomal vectors. Stem Cells Transl Med. 3, 787-791 (2014).
- Higgins, C. A., et al. Reprogramming of human hair follicle dermal papilla cells into induced pluripotent stem cells. J Invest Dermatol. 132, 1725-1727 (2012).
- Muchkaeva, I. A., et al. Generation of iPS Cells from Human Hair Follice Dermal Papilla Cells. Acta naturae. 6, 45-53 (2014).
- Naaldijk, Y., Friedrich-Stockigt, A., Sethe, S., Stolzing, A. Comparison of different cooling rates for fibroblast and keratinocyte cryopreservation. J Tissue Eng Regen. , (2013).
- Sporl, F., et al. Real-time monitoring of membrane cholesterol reveals new insights into epidermal differentiation. J Invest Dermatol. 130, 1268-1278 (2010).
- Conner, D. A., et al., Ausubel, F. N., et al. Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation. Current protocols in molecular biology. 23, Unit 23 22 (2001).
- Pebay, A., et al. Essential roles of sphingosine-1-phosphate and platelet-derived growth factor in the maintenance of human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 1541-1548 (2005).
- Myung, P., Ito, M. Dissecting the bulge in hair regeneration. J Clin Invest. 122, 448-454 (2012).
- Alonso, L., Fuchs, E. The hair cycle. J Cell Sci. 119, 391-393 (2006).
- Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481, 295-305 (2012).
- Soares, F. A., Sheldon, M., Rao, M., Mummery, C., Vallier, L. International coordination of large-scale human induced pluripotent stem cell initiatives: Wellcome Trust and ISSCR workshops white paper. Stem cell reports. 3, 931-939 (2014).
- McKernan, R., Watt, F. M. What is the point of large-scale collections of human induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 31, 875-877 (2013).
- Utikal, J., et al. Immortalization eliminates a roadblock during cellular reprogramming into iPS cells. Nature. 460, U1145-U1112 (2009).
- Xu, Y., et al. Proliferation rate of somatic cells affects reprogramming efficiency. J Biol Chem. 288, 9767-9778 (2013).
- Liu, J., et al. Late passage human fibroblasts induced to pluripotency are capable of directed neuronal differentiation. Cell Transplant. 20, 193-203 (2011).
- Huallachain, M., Karczewski, K. J., Weissman, S. M., Urban, A. E., Snyder, M. P. Extensive genetic variation in somatic human tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 18018-18023 (2012).
- Abyzov, A., et al. Somatic copy number mosaicism in human skin revealed by induced pluripotent stem cells. Nature. 492, 438-442 (2012).
