This manuscript provides a step-by-step procedure for the derivation and maintenance of human keratinocytes from plucked hair and subsequent generation of integration-free human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) by episomal vectors.
Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using patient-specific hiPSCs allows the study of the underlying mechanism for pathogenesis, also providing a platform for the development of in vitro drug screening and gene therapy to improve treatment options. The promising potential of hiPSCs for regenerative medicine is also evident from the increasing number of publications (>7000) on iPSCs in recent years. Various cell types from distinct lineages have been successfully used for hiPSC generation, including skin fibroblasts, hematopoietic cells and epidermal keratinocytes. While skin biopsies and blood collection are routinely performed in many labs as a source of somatic cells for the generation of hiPSCs, the collection and subsequent derivation of hair keratinocytes are less commonly used. Hair-derived keratinocytes represent a non-invasive approach to obtain cell samples from patients. Here we outline a simple non-invasive method for the derivation of keratinocytes from plucked hair. We also provide instructions for maintenance of keratinocytes and subsequent reprogramming to generate integration-free hiPSC using episomal vectors.
मानव प्रेरित स्टेम सेल (hiPSCs) की खोज के रोगी-विशिष्ट स्टेम कोशिकाओं को 1-3 की पीढ़ी के लिए एक व्यावहारिक विधि उपलब्ध कराने, पुनर्योजी चिकित्सा के क्षेत्र में क्रांति ला दी है। hiPSCs सफलतापूर्वक fibroblasts के 4,5, hematopoietic कोशिकाओं 6,7, मूत्र 8 से गुर्दे की उपकला कोशिकाओं और 9,10 केरेटिनकोशिकाओं सहित विभिन्न दैहिक प्रकार की कोशिकाओं से उत्पन्न किया गया है। तिथि करने के लिए, त्वचा fibroblasts और hematopoietic कोशिकाओं रोगी-विशिष्ट IPSCs पैदा करने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल सेल के सूत्रों का प्रतिनिधित्व करते हैं। बेशक, यह त्वचा बायोप्सी और रक्त संग्रह नियमित चिकित्सा प्रक्रियाओं और कई देशों में स्थापित किया गया है रोगी के रक्त या त्वचा के नमूनों की बड़ी biobanks कर रहे हैं कि इस तथ्य के कारण है।
रक्त कोशिकाओं और आक्रामक निकासी तरीकों की आवश्यकता होती है जो त्वचा तंतुप्रसू के विपरीत, केरेटिनकोशिकाओं hiPSC पीढ़ी के लिए एक आसानी से सुलभ सेल प्रकार का प्रतिनिधित्व करते हैं। Keratinocytतों त्वचा की बाहरी एपिडर्मल बाधा के रूप में और भी नाखून और बालों 11 में पाए जाते हैं कि केरातिन युक्त उपकला कोशिकाओं रहे हैं। विशेष रूप से, केरेटिनकोशिकाओं बालों के रोम, भीतर जड़ म्यान (आईआरएस) कोशिकाओं (12, चित्रा 1) के साथ मिलकर बाल शाफ्ट कवर किया है कि एक बाहरी सेलुलर परत के बाहरी जड़ म्यान (ओआरएस) पर पाया जा सकता है। बाल संग्रह चिकित्सा कर्मियों की सहायता की आवश्यकता नहीं है कि एक साधारण प्रक्रिया है के रूप में रोगियों को इकट्ठा करने और बहुत hiPSC पीढ़ी के लिए रोगी के नमूने के संग्रह की सुविधा होगी जो प्रयोगशालाओं, के लिए अपने स्वयं के बाल के नमूने भेजने के लिए, यह एक अवसर प्रदान करता है। एपिडर्मल केरेटिनकोशिकाओं भी hiPSC पीढ़ी 9,13 के लिए शुरू की कोशिकाओं के रूप में केरेटिनकोशिकाओं उपयोग कर के लाभ के लिए, उनका कहना है fibroblasts की तुलना में एक उच्च reprogramming दक्षता और तेजी से reprogramming के कैनेटीक्स है। इसके अलावा, hiPSCs भी बाल कूप के भीतर अन्य सेल आबादी का उपयोग कर उत्पन्न किया जा सकता है,बाल कूप 14,15 के आधार पर स्थित त्वचीय papilla कोशिकाओं सहित।
बाल-व्युत्पन्न कोशिकाओं का उपयोग IPSC पीढ़ी की पिछली रिपोर्टों अक्सर रेट्रोवायरल या lentiviral आधारित reprogramming के तरीकों को 9,14,15 का उपयोग। हालांकि, इन वायरल तरीकों reprogramming के दौरान विदेशी transgenes की अवांछनीय जीनोमिक एकीकरण परिचय। इसकी तुलना में, episomal वैक्टर का उपयोग एकीकरण मुक्त IPSCs 4 उत्पन्न करने के लिए एक व्यावहारिक, गैर वायरल reprogramming विधि का प्रतिनिधित्व करता है। हम पहले से कुशलतापूर्वक episomal वैक्टर 13 का उपयोग कर hiPSCs में keratinocyte reprogram करने के लिए एक सरल, लागत प्रभावी और गैर-वायरल तरीका विकसित किया है। यहाँ हम साहसपूर्ण बाल, विस्तार और केरेटिनकोशिकाओं के रखरखाव और hiPSCs उत्पन्न करने के लिए बाद में reprogramming से केरेटिनकोशिकाओं की व्युत्पत्ति सहित keratinocyte व्युत्पन्न hiPSCs, की पीढ़ी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।
रोगी-विशिष्ट hiPSCs की पीढ़ी के लिए इन विट्रो में रोगग्रस्त प्रकार की कोशिकाओं में रोगजनन के अध्ययन के लिए एक अनूठा तरीका प्रदान करता है, और यह भी रोग phenotypes के बचाव कर सकते हैं कि उपन्यास के अणुओं की पहचान ?…
The authors have nothing to disclose.
The authors wish to thank Harene Ranjithakumaran and Stacey Jackson for technical support. This work was supported in part by grants from the National Health and Medical Research Council (R.C.B. Wong, A. Pébay), the University of Melbourne (R.C.B. Wong), Retina Australia (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung, A. Pébay) and the Ophthalmic Research Institute of Australia (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung, A. Pébay); Australian Research Council Future Fellowship (A. Pébay, FT140100047), Cranbourne Foundation Fellowship (R.C.B. Wong); intramural funding from the National Institutes for Health (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung) and operational infrastructure support from the Victorian Government.
Antibiotic Mix: | |||
250 ng/ml Antimycotic amphotericin B | Sigma | A2942-20ml | Antibiotic mix is made up in PBS. |
1X Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
PBS (-) | Invitrogen | 14190-144 | |
Knockout Serum Replacement (KSR) medium: | KSR medium is filtered using Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) before use. bFGF is added fresh to the media before use. | ||
20% knockout serum replacement (KSR) | Invitrogen | 10828-028 | |
DMEM/F12 with glutamax | Invitrogen | 10565-042 | |
1× MEM non-essential amino acid | Invitrogen | 11140-050 | |
0.5× Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
0.1 mM β-mercaptoethanol | Invitrogen | 21985 | |
bFGF (10 ng/ml, added fresh) | Millipore | GF003 | |
Keratinocyte medium: | |||
EpiLife with 60 µM Calcium | Invitrogen | M-EPI-500-CA | |
1× Human keratinocyte growth supplement (HKGS) | Invitrogen | S-001-5 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) medium: | FBS medium is filtered using Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) before use. | ||
10% fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 26140079 | |
DMEM | Invitrogen | 11995-073 | |
0.5× Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
2 mM L-glutamine | Invitrogen | 25030 | |
0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | |
Extracellular Matrix (ECM): | |||
Matrigel | Corning | 354234 | Aliquot Matrigel stock and store in -80°C following manufacturer’s instructions. Stock concentration of Matrigel varies slightly from batch to batch (~9mg/ml). We recommend to use 200µl matrigel for coating a 12-well plate (~150µg/well). |
Coating Matrix Kit | Invitrogen | R-011-K | |
Plasmids: | Note that pCXLE-eGFP is only used for monitoring transfection efficiency and is not required for reprogramming. | ||
- pCXLE-eGFP | Addgene | 27082 | |
- pCXLE-hOct3/4-shP53F | Addgene | 27077 | |
- pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | |
- pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | |
Transfection reagent Fugene HD | Promega | E231B | |
Gelatin (from porcine skin) | Sigma | G1890 | Make up 0.1% gelatin in distilled water. Autoclave before use. |
Reduced Serum medium: OPTI-MEM | Invitrogen | 31985062 | |
Accutase | Sigma | A6964-100ml | |
Mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder | MEF can be inactivated by mitomycin C treatment or irradiation as described previously 16. | ||
26G needle | Terumo | NN2613R | |
6-well plate (tissue culture treated) | BD Biosciences | 353046 | |
12-well plate (tissue culture treated) | BD Biosciences | 353043 | |
10 cm dish (tissue culture treated) | BD Biosciences | 353003 | |
Dispase | Invitrogen | 17105-041 | Use at 10mg/ml |
Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | Use at 1mg/ml |
TRA-160 antibody | Millipore | MAB4360 | Use at 5µg/ml |
OCT4 antibody | Santa Cruz | SC-5279 | Use at 5µg/ml |
NANOG antibody | R&D Systems | AF1997 | Use at 10µg/ml |
MycoAlert Detection kit | Lonza | LT07-418 |