Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.
In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.
Compreender os mecanismos pelos quais as proteínas da membrana cumprem a sua função celular muitas vezes pode ser uma tarefa desafiadora, porque os seus modos de ação são frequentemente definidos por interações de baixa afinidade, que são difíceis de detectar e avaliar por metodologias bioquímicas convencionais. Proteínas de membrana pode ainda ser altamente enriquecido em domínios específicos de membrana 5,6 ou formam dinâmicas estruturas de ordem superior, que podem, em princípio, alterar a sua actividade biológica 7.
Microscopia única molécula de fluorescência assistida por laser não-invasivo tornou-se assim a metodologia de escolha para estudar o comportamento de proteínas celulares em ambientes complexos. Isto é particularmente verdadeiro no caso de processos bioquímicos que ocorrem na membrana plasmática, pois estes podem, em princípio, ser monitorado no modo de redução de ruído reflexão interna total (TIRF). Aqui a iluminação da amostra se restringe a uma fatia de até 200 nm-fino em estreita proximidade com um copo surface, o que resulta em uma perda significativa no fundo celular e, devido às características da luz de excitação evanescente, também num aumento substancial na intensidade de fluorescência de sinal de 8,9. Ambos os aspectos são importantes quando se aponta em alta resolução posicional e temporal na detecção molécula única.
Planar SLBS não só são compatíveis com microscopia TIRF. Quando funcionalizado com ligantes apropriados eles também fornecem acesso directo ao estudo das dinâmicas moleculares de reconhecimento célula-célula à medida que ocorrem em células imunes ou outras células. Eles também podem ser simplesmente utilizada para posicionar células móveis e de outra forma não-aderentes suficientemente perto da placa de vidro de modo a que tais células podem ser visualizados na iluminação TIRF, o que é altamente desejável quando as experiências de condução envolvem único rastreamento molécula ou única SuperResolution à base de molécula. Para este fim as proteínas têm de ser carregado numa SLB altamente móvel. Uma vantagem inerente do Li usadas PIDs são de que não há nenhuma ligação não específica de proteínas em tudo. Além disso, SLBS podem ser consideradas como líquidos bidimensionais com uma capacidade inerente de curar-se; irregularidades no âmbito do suporte de vidro são compensados até um certo grau. Um protocolo passo passo é fornecida para gerar bilayers altamente móveis carregadas com proteínas de interesse. A formação de SLBS planares está descrito, que contém de 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC) como o ingrediente principal (90-99%) e o lípido sintético e funcionalizado 1,2-dioleoyl- sn-glicero-3 – {[N- (5-amino-1-carboxipentil) ácido iminodiacético] succinil} sal de níquel (Ni-NTA DGS) em baixa abundância (1-10%). POPC transporta um ácido gordo saturado e um ácido gordo mono-insaturado e formam bicamadas lipídicas de elevada fluidez, mesmo à temperatura ambiente. DGS NTA-Ni liga-se com a sua headgroup para caudas de poli-histidina e serve como âncora para proteínas poli-histidina-tag de escolha (Figura 1).
"> Importante, o hardware microscopia deve incluir um certo número de periféricos que são descritos abaixo. Com a informação fornecida e algum conhecimento básico em óptica e física do laser, qualquer biólogo deve ser capaz de construir uma configuração única molécula de imagem. Amostra de excitação deve ser idealmente realizada em um microscópio invertido em modo de reflexão interna total (TIRF) como este regime reduz a luz espúrias e fundo excessivo resultante de outra forma a partir celular auto-fluorescência 9. Para isso, um objectivo especial TIRF-capaz (ver abaixo) e iluminação do laser são necessários. Algumas experiências requerem tempos de iluminação dentro da gama milissegundo e operado em sucessão rápida. Para poupar tempo de iluminação ou para evitar branqueamento desnecessário causado pela iluminação repetitivo é muitas vezes útil para dividir a luz emitida em dois ou mais canais espectrais. Isto permite a leitura simultânea de dois ou mais perfis de emissão, o que pode tornar-se um factor significativo quando conducexperiências ting envolvendo Transferência Förster Ressonância Energia (FRET). Aqui a emissão resultante do único pulso de luz de excitação podem ser gravados tanto do doador FRET FRET e receptor (como emissão sensibilizados). A câmera deve capturar fótons suficientes com fundo suficientemente baixo para visualizar fluorophores individuais durante o tempo de iluminação. O software de computador terá que ser à altura da tarefa de sincronizar fechamento de excitação e de aquisição de imagem. Uma visão global é dada abaixo e na Figura 2:Objectivo TIRF capaz-: Para a iluminação baseadas em TIRF objectivo a abertura numérica (NA), o objectivo deve ser igual a ou maior do que 1.4, utilizando lâminas de vidro padrão (n = 1.515) 9. A ampliação pode variar entre 60x a 150x. O objetivo deve ser cromaticamente corrigida para permitir confocalidade quando imagiologia diferentes fluoróforos.
Lasers: O número de lase disponívelOpções r tem aumentado significativamente nos últimos anos. Modern eletronicamente moduláveis lasers de diodo de onda contínua são eficientes em termos de custo e pode ser operado com frequência e velocidade sem precedentes. Lasers de iões de gás mais caros se destacam em qualidade de feixe laser, mas exigem fechamento externo (ver abaixo) e, muitas vezes extensa (água) de arrefecimento.
Persianas Excitação: moduladores acusto-ópticos (OMA) permitem fechamento rápido em rápida sucessão 10. Para apertado fechando a combinação de um AOM com obturadores mecânicos é recomendado. Desta forma extensa aquecimento da OMA devido à exposição à luz contínua é evitada e luz vazando da OMA no off-posição é cancelada.
As lentes são usadas para alargar a feixes de laser e para concentrá-los no plano focal de trás da objectiva. Desta forma, a luz de excitação deixa o objectivo como um feixe paralelo (Figura 3), que é necessária para a iluminação de TIRFa amostra. Movendo-se o ponto focal no interior do plano focal posterior a partir do centro para a periferia do objectivo vai mudar o ângulo a que o feixe deixa o objectivo, mas não o local do ponto de laser na amostra (Figura 3), que é uma função da geometria global do feixe. Iluminação TIRF segue a um ângulo critico, que pode ser ajustada através de um conjunto de espelhos que funcionam como um periscópio para traduzir o ponto focal do laser no interior do plano focal da objectiva. Lentes devem ser cromaticamente corrigida e pode ser usado em um conjunto de dois ou três lentes. Um sistema de três lente consiste de duas lentes que actuam como um telescópio para alargar o feixe de laser (e, portanto, o ponto de iluminação na amostra) e uma terceira lente para focar o feixe alargada para o plano focal posterior da objectiva (Figura 4). Ambas as funções (telescópio e de focagem) pode também ser conseguida por uma combinação de apenas duas lentes (ver Figura 4).
<p class="jove_content"> Espelhos deve ser de pelo menos 95% reflectora para evitar a perda de luz laser. Para cada feixe ajuste de um conjunto de dois espelhos é normalmente aplicado como tal arranjo é suficiente para ajustar precisamente qualquer ângulo e a posição de um feixe de laser.Sobreposições dicróicas refletir e transmitir a luz de diferentes comprimentos de onda específicos e são utilizados para sobrepor ou dividir as vigas de dois lasers.
Polychroic filtros são mais complexos do que os filtros dicróicas e são necessários para refletir a luz de excitação de entrada e transmitir sair emissão de luz a partir da amostra. Eles são colocados no cubo de filtro entre a lente objectiva e o tubo de microscópio.
Limpar filtros: Dependendo do tipo de employe a laser d laser de limpar os filtros com uma largura de banda de transmissão estreita deve ser colocado para o raio laser logo após ele deixa a laser.
Filtros Notchsão projetados para absorver de forma eficaz luz laser com uma largura de banda estreita e transmitir toda a outra luz. Eles são colocados no caminho de emissão para filtrar qualquer luz de excitação laser de espúrio. No entanto, os filtros notch trabalhar apenas a 0 ° de ângulo de entrada. Se a largura de banda-do filtro de corte é muito afiada, os diferentes ângulos de entrada não pode ser refletida mais. Bloqueio de luz laser a laser colimado não é afetado, mas a luz back-dispersa não pode ser eficazmente impedida de alcançar a câmera.
Rodas de filtros motorizados equipados com rodas de filtros adequados podem ser facilmente colocados na via de excitação e de emissão e permitir a comutação simples entre diferentes intensidades de luz (quando equipado com filtros ND) ou canais fluorescentes (quando colocado em frente de um xénon ou lâmpada de mercúrio de arco para raciométrica Imagem de cálcio ou na frente da câmera para selecionar para o fluoróforo emissor de luz).
50:50 cubo divisor de feixe cum ser usado para dividir em dois feixes de laser percursos dos feixes de excitação separada e também para combiná-las em frente de periscópio.
Divisor de feixe (trajeto de emissão): Para a aquisição rápida de imagens sem qualquer necessidade de troca de filtros físicos, o feixe de emissão é dividido em um canal de azul-vermelho-deslocada e deslocada. Em princípio, divisores de feixe pode ser construída através da utilização de uma cunha dicróico ou um conjunto de espelhos e um espelho dicróico para separar o feixe de emissão de um modo dependente do comprimento de onda. Dois filtros de emissão são necessários para limpar os canais emitidos.
Filtro espacial: a filtragem espacial do feixe de excitação é por vezes necessária para remover os raios de luz não paralelos emitidos a partir de feixes de laser de baixa qualidade. Um filtro espacial consiste de um telescópio de duas lentes com um pequeno orifício colocado exatamente no ponto focal de ambas as lentes. Esta luz espúrias maneira resultante a partir de porções não-paralelas de o feixe de laser torna-se eficientemente bloqueados. Such condições devem ser atendidas ao estabelecer microscopia baseado em TIRF. Filtragem espacial aumenta com orifícios mais pequenos, que são mais difíceis de posicionar no ponto focal, e com distâncias focais menores da primeira lente. Para reduzir os efeitos causados por aberrações da lente é vantajoso empregar em vez de lentes simples de alta qualidade e os objetivos do microscópio corrigido ao infinito com baixa ampliação (10x ou 20x).
Periscópio: Uma configuração de periscópio é necessária para converter o feixe de laser focado no plano focal posterior do objectivo, um pré-requisito para imagiologia TIRF. Ele pode ser facilmente construído a partir de dois espelhos de duas polegadas, um estágio de translação para ajustar o primeiro espelho e um posto para o posicionamento do segundo espelho para reflectir o feixe focado e alargado de excitação para o microscópio (Figura 5).
Câmera: retro-iluminado Electron Devices Multiplicando-Charge Coupled (EMCCD) são rotineiramente usados paraa gravação de sinais de moléculas individuais. Isto é devido à sua elevada eficiência quântica (até 95%), elevada velocidade de aquisição (até 30 MHz) e comparativamente baixo ruído. Arrefecendo-se a -80 ° C, reduz o ruído térmico e é suportada por um certo número de câmaras EMCCD actualmente disponíveis. A limitação da tecnologia EMCCD é que o ruído da câmera aumenta linearmente com o tanto o ganho da câmera eo sinal a ser capturado. Este não é o caso com CMOS (scmos) câmaras científicas, que são significativamente menos dispendiosos e funcionam devido à arquitectura especial do chip scmos também muito mais rápido do que as câmaras EMCCD. No entanto, um problema associado com a tecnologia CMOS é que a aquisição da imagem ainda carece de algum grau de uma leitura quantitativa em um único nível molécula, porque cada pixel apresenta diferente sensibilidade de detecção. Em princípio isto pode ser compensado por meio de pixel normalização, mas este processo não é de forma triviais 11. É por isso que ainda hesitam em reRecomendo câmeras scmos para microscopia molécula única, mas tendo em vista o rápido desenvolvimento desta tecnologia, as câmeras scmos pode em breve se tornar a câmera de escolha. Câmeras CCD de varredura lenta câmeras evitar ruído e de pixel variância relacionada amplificação-todos juntos e apoiar taxas de aquisição de mais rápido se eles podem ser operados em um modo chamado "cinético". Neste modo, o chip inteiro de câmara excepto para uma região de interesse (ROI) é mascarado, o que faz com que seja possível utilizar o próprio chip como um dispositivo de armazenamento. Após a ROI é exposta pela primeira vez, as cargas resultantes são deslocadas para a área mascarada da linha de pixel do pixel de chips por linha, em que a imagem está protegida da exposição à luz adicional. Uma vez que a mudança de todas as linhas do ROI na região mascarada está concluída (na gama de sub-milissegundos), o próprio ROI está pronto para a próxima exposição. Este ciclo é repetido até que todas as linhas de pixels do chip CCD estão carregadas. O chip é então lido para fora lentamente com marcadamente reduruído de leitura ced. Por exemplo em um chip de pixel 1000 x 1300, 20 ROIs de 50×50 pixel pode ser gravado em rápida sucessão. Uma vez que as imagens permaneçam no chip durante um tempo considerável, antes de ser lido, é crítico para assegurar o mascaramento de alta qualidade e para arrefecer a câmara (por exemplo, com azoto líquido) na forma de um meio para reduzir o ruído térmico excessivo. Algumas câmeras EMCCD também suporta o modo de cinética.
Software: O sincronismo dos lasers, persianas, OMA e exposição da câmara, bem como armazenamento de imagem adequada são parte integrante de qualquer experimento de imagem bem sucedida. Em princípio, muitas operações definidas pode ser programado com pacotes de software disponíveis que vêm com a câmera. Pacotes de software comerciais apoiar um grande número de periféricos de hardware, que podem ser implementados com pouco know-how técnico.
Gerador de pulso, Aquisição de Dados (DAQ) placa (com canais analógicos e saídas digitais) e osciloscópio: Um gerador de pulso é umexcelente escolha para converter impulsos de disparo em impulsos de tensão e de tempo definido. Desta forma, lasers pode ser controlada com precisão para potência de saída e cronometrado no milissegundo a gama sub-milissegundo. DAQ com placas de saídas analógicas alcançar o mesmo e são facilmente integrados na placa-mãe do computador através de slots PCI. A duração do impulso, amplitude e frequência são verificados com um osciloscópio.
Protecção de todo o caminho do feixe de excitação: Para evitar flutuações no perfil de excitação devido a convecções ar o caminho inteiro feixe de excitação deve ser fechados a partir do seu ambiente de laboratório. Esta medida é especialmente importante quando a realização de microscopia TIRF. Os componentes ópticos também estão protegidos contra a poeira e o olho humano da exposição à luz laser. Os compartimentos podem ser facilmente construir a partir da placa de cartão preto, que pode ser comprado em lojas de materiais de artes.
Para determinar a fluidez da recuperação SLB fluorescência após Photobleaching medições (FRAP) 12 são executadas. Para FRAP a existência de dois percursos dos feixes de excitação é aconselhável (ver Figura 3). O primeiro percurso de feixe é concebido para a imagem da fluorescência da bicamada. Isto pode ser feito na configuração TIRF e com baixa intensidade de luz. O segundo percurso de feixe deve permitir a um pulso curto lixívia mas intensa e deve ser configurado de modo não-TIRF, de modo que deixa o objectivo ao longo do eixo óptico. Uma abertura redonda pode ser colocada no caminho do feixe de excitação (ver Figura 8) para projectar um perfil de lixívia perfeitamente redondo com arestas definidas. A fim de imagem desta abertura para o plano do objecto, da sua posição óptima seria no plano focal da lente 3 (ver Figura 3). No entanto, devido à grande distância focal desta lente, uma imagem com qualidade suficiente abertura pode também ser gerada, quando a abertura é colocado em posições ligeiramente deslocada.
Depois de ter realizado tele imagiologia de experiência os dados em bruto deve ser analisada de forma adequada. Vários protocolos passo-a-passo são oferecidos, que cobrem o ajuste das configurações principais (por exemplo, energia e iluminação de tempo, ângulo TIRF), aquisição e análise dos dados.
Microscopia molécula única proporciona a oportunidade única de estudar o comportamento de proteínas dentro de seu ambiente nativo celular. A imagem molecular torna-se, portanto, cada vez mais atraente para uma ampla comunidade científica, mas muitos cientistas de vida ainda coíbe de o investimento inicial em tecnologia e conhecimento. A principal vantagem resultante da montagem do próprio sistema de imagem é que ele pode ser facilmente ajustado com a necessidade específica de qualquer um.
Tal como aqui sugeriu uma TIRF-non feixe de excitação pode ser facilmente aplicadas, para além de um caminho de luz TIRF existente, se foto-branqueamento rápido e definido (ou -activation) de fluoróforos e ligantes é desejada, por exemplo, ao realizar experimentos FRAP ou ligando uncaging 14 . A introdução de um divisor de feixe de emissão permite a gravação simultânea de pelo menos dois e, em alguns casos até quatro canais fluorescentes. A lista de extensões é, em essência, limitado apenas pelaa própria imaginação.
Por exemplo, a implementação de uma roda de filtro de emissão motorizada no caminho de emissão permite a comutação rápida entre até dez canais fluorescentes diferentes. Ao combinar duas rodas motorizadas filtro de emissão (cada um equipado com ranhuras de filtro 10) em série, até 18 canais fluorescentes podem ser lidas. Imagens baseadas em TIRF pode ser complementada com medidas de mobilização de cálcio e Interferência Reflexão Microscopia (IRM) após a integração de um caminho de lâmpada Xenon de excitação ou Mercury. IRM é o método de escolha para visualizar o grau ao qual as células estão ligadas à superfície de vidro ou um SLB e pode, portanto, fornecer informações críticas na interpretação dos dados de imagem à base de TIRF. O estabelecimento de um feixe de excitação alargada com a utilização de um espelho dicróico simples e um laser de 405 nm adicional permite a realização de microscopia de fotoactivação localização (Palm) ou microscopia óptica reconstrução estocástica (Storm), isto é, dois superresolutmetodologias de iões com uma precisão posicional abaixo do limite de difração da luz visível 15,16.
No entanto, o sucesso experimental não é apenas uma questão de hardware apropriado. Para tirar o máximo proveito de imagem baseado em TIRF reduzido ruído, as células devem fazer contato com uma superfície de uma forma que não imponha restrições na superfície da célula ou que interfira com a fisiologia da sua membrana plasmática. SLBS funcionalizado com proteínas adequadas para adesão celular estão superando bem adequado para esta finalidade, pois todos os ligantes SLB-incorporados são lateralmente móveis e ajustar a sua posição lateral dentro da bicamada em resposta ao receptor dinâmica de ligação e de segregação.
Para fabricar SLBS de forma reproduzível, o melhor é começar com veículos utilitários esportivos de alta pureza. Tal como aqui descrito, é, portanto, essencial para remover vesículas multilamelares, que também são produzidas durante a sonicação, em dois passos de ultracentrifugação como estes interfere com a formação de SLBS contíguos caracterizam elevada fluidez. SLBS de forma alta qualidade apenas em superfícies de vidro limpo. Uma vez que as lâminas de vidro limpas deve ser utilizado imediatamente ou armazenado em vácuo. Importante, SLBS não deve nunca ser exposta ao ar, pois isso levaria a sua interrupção. SLB envolve a lavagem, tal como mostrado, com tampão de lavagem a utilização de uma pipeta serológica, como este é não só um processo mas também economizar poupar tempo.
Durante a colheita e purificação de proteínas residentes SLB a utilização de detergentes deve ser evitada. Isto é porque o detergente irá reduzir significativamente a mobilidade da proteína, mesmo quando presentes em quantidades vestigiais. Para contornar a necessidade de detergente todos juntos, expressão solúvel de poli-histidina secretado ligantes equipada tag é recomendado em células de mamíferos ou de insectos. Se o re-enrolamento a partir de corpos de inclusão de E. coli é necessário, cuidado deve ser aplicado para remover detergentes eficaz a partir dos corpos de inclusão antes da sua un- e redobragem.
Uma vantagem principal de empregar SLBS resultados da sua natureza modular e de reconstituição, que permite especificamente para dissecar o papel de uma interacção ligando-receptor dado para a activação da célula e adesão celular. A este respeito, é importante mencionar que os SGD NTA-Ni deve estar presente em 10% dentro do SLB, a fim de impedir que as proteínas que competem para locais de ligação de NTA-Ni. Quando se emprega SLBS albergando apenas 1% ou 2% DGS NTA-Ni, uma redução na associação das dada uma espécie de proteína marcada com poli-histidina podem ser notados, especialmente quando co-incubação de quantidades crescentes de uma segunda espécie de proteína de poli-histidina marcada com (não publicado observação). Este fenômeno não é observado quando se trabalha com SLBS caracterizam 10% DGS NTA-Ni.
Embora nunca tenham observado a ligação não específica de proteína de poli-histidina de qualquer marcadas testados para SLBS contendo DGS NTA-Ni, esta possibilidade deve ser ensaiada por ocasião da introdução de uma proteína para o primeiro tempo,Para este fim, recomendamos o uso de SLBS desprovidas de DGS NTA-Ni (a proteína não deve ligar). Em segundo lugar, quando se usa uma SLB contendo DGS NTA-Ni, a proteína deve sair completamente depois de lavar o SLB com PBS contendo 300 mM imidazol.
Outra vantagem significativa dos empregando SLBS é que as interacções transientes e eventos de sinalização pode ser monitorada com uma melhor resolução espaço-temporal 17-19. Isto é, pelo menos, em parte por causa de um processo de ligação tridimensional é essencialmente reduzida a duas dimensões de imagem, especialmente quando se grava em modo TIRF ruído atenuado. O uso de SLBS é compatível com a detecção de sinais única molécula, um pré-requisito para a microscopia activado foto-localização (PALM) ou estocástica microscopia óptica reconstrução (STORM), microscopia SuperResolution ou seja, com uma resolução abaixo do limite de difração 15,16. Essas modalidades de imagem especiais permitem única molécula Förster Ressonância Energia Traexperimentos nsfer concebido para visualizar as interacções proteína-proteína individuais num ambiente sináptica 20. Esta abordagem é explicado em detalhe considerável em uma publicação JoVE 21 denominado "Medição de ligação utilizando um ensaio com base em microscopia de TCR-pMHC FRET".
Ao interpretar experimentos baseados no SLB deve-se sempre ter em mente que nem todas as propriedades de uma membrana plasmática de uma célula viva são caracterizados por SLBS, e que algumas das qualidades que faltam pode afetar a fisiologia sob investigação. Afinal, proteínas SLB-incorporados são livremente difundir e não organizados em microdomínios de membrana como a maioria dos seus homólogos celulares são 5,6,22. Folhas de membrana de plasma imobilizadas derivadas de células aderentes, que conservam a arquitectura da membrana plasmática de células vivas em algum grau, foram empregues com sucesso para estudar a absorção de antigénios de membrana incorporado por linfócitos-B 23. Contudo, mesmo taismembranas não interagem com um citoesqueleto altamente dinâmico e apresentam nenhuma flexibilidade como eles são apoiados por uma superfície de vidro rígida. Tendo em conta estas discrepâncias, há claramente uma necessidade de SLBS engenharia, que oferecem meios para compartimentar as proteínas de uma forma definida e que são apoiados por superfícies de flexibilidade ajustável ou por superfícies que mudam a sua rigidez em resposta a pulsos de luz aplicados localmente.
The authors have nothing to disclose.
MA foi apoiado por uma bolsa de Schrödinger do Fundo austríaco Science (FWF, J3086-B11) e graças a Max-Planck-Sociedade de apoio financeiro e administrativo. GS foi apoiada pelo Fundo de Ciência e Tecnologia de Viena (WWTF, LS13-030). JH foi apoiada pelo Fundo de Ciência e Tecnologia de Viena (WWTF, LS14-031).
#1.5 glass slides | VWR | 631-0853 | |
250ml round bottom flask | VWR | 201-1357 | |
50:50 beam splitter cubes | Thorlabs | BS013 | |
Acousto-opitcal modulator C1205-2 | Isomet | – | only necessary if CW lasers, which cannot be modulated, are used |
Alexa Fluor 488-NHS | Life technologies | A-20000 | |
Alexa Fluor 555-NHS | Life technologies | A-20009 | |
Alexa Fluor 647-NHS | Life technologies | A-20006 | |
autoclave tape | VWR | 489-1312 | or any other heat-stable sticky tabe |
Avanti Mini-Extruder | Avanti Lipids | 610000 | alternative to the bath sonicator |
bath sonicator QSONICA Q700 | QSONICA | Q700 | |
beam splitter | Cairn | P280/210/MLS | |
Büchi rotary evaporator | VWR | 531-0837 | |
camera | Andor | iXon Ultra 897 | see manuscript text for alternatives |
concentarted hydrogenperoxide | Roth | 9683.1 | |
concentrated sulfuric acid | Roth | X944.2 | |
epoxy glue | Uhu | 45705 | Uhu plus sofortfest 2min |
filter wheel | Sutter instruments | Lambda 10-2 | |
LabTek chambers | VWR | 734-2062 | |
laser | Toptica | – | different variants (wavelengths 375 – 785 nm) are available |
lens | Thorlabs, Newport | – | |
DGS NTA-Ni (lipid) | Avanti Lipids | 790404C | already in Choroform-solved delivered version of the nicekl salt variant is recommended |
POPC (lipid) | Avanti Lipids | 850457C | already in Choroform-solved delivered version is recommended |
microscope Zeiss Axiovert 200 | Zeiss | – | |
mirrors | Thorlabs | BB1-E02 | |
optical filters | AHF, Chroma, Semrock | – | filter sets are available for many different combinations of dyes |
oscilloscope | BK Precision | 2120C | |
phosphate buffered saline (PBS) | Life technologies | 14190-136 | degas before usage |
periscope | Thorlabs | RS99/M | |
picodent twinsil 22 | Picodent | 13001000 | alternative to the epoxy glue |
power meter Lasermate-Q | Coherent | – | any powermeter sensitive in the used spectral range will do |
pulse generator | Stanford Research Systems | SRS DG535 | |
spatial filter | Thorlabs | KT310/M | |
syringe filter 0.2µm | Millipore | GVWP04700 | |
TIRF-capable apochromat objective 100x, NA 1.46 | Zeiss | 440782-9800-000 | |
trichloromethane/chloroform | Roth | 3313.1 | |
tubes forultracentrifugation polycarbonate 1.00 mm, 11 mm x 32 mm | Thermo Fisher | 45237 | |
Sorvall ultracentrifuge | Thermo Fisher | RC M150GX | |
ultracentrifuge rotor | Thermo Fisher | S120-AT2 | |
UV spectrophotometer Nanodrop 2000c | Thermo Fisher | – | |
vacuum pump | VWR | 181-0248 |