This manuscript describes how to conduct (single molecule) Förster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer.
T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen Presenting Cells (APCs). This is despite T-cell antigen receptors (TCRs) exerting usually a moderate affinity (µM range) to antigen when binding is measured in vitro1. In view of the molecular and cellular parameters contributing to T-cell antigen sensitivity, a microscopy-based methodology has been developed as a means to monitor TCR-pMHC binding in situ, as it occurs within the synapse of a live T-cell and an artificial and functionalized glass-supported planar lipid bilayer (SLB), which mimics the cell membrane of an Antigen presenting Cell (APC) 2. Measurements are based on Förster Resonance Energy Transfer (FRET) between a blue- and red-shifted fluorescent dye attached to the TCR and the pMHC. Because the efficiency of FRET is inversely proportional to the sixth power of the inter-dye distance, one can employ FRET signals to visualize synaptic TCR-pMHC binding. The sensitive of the microscopy approach supports detection of single molecule FRET events. This allows to determine the affinity and off-rate of synaptic TCR-pMHC interactions and in turn to interpolate the on-rate of binding. Analogous assays could be applied to measure other receptor-ligand interactions in their native environment.
Een fundamenteel begrip van hoe T-cellen herkennen antigenen moeten kijken naar de juiste plaats, dat wil zeggen binnen de immunologische synaps gevormd tussen de T-cel en de APC. Hier worden moleculaire bindingskinetiek niet alleen bepaald door de inherente biochemische eigenschappen van de betrokken maar interactiepartners hangen in hoge mate af van cellulaire parameters, die cellulaire krachten membraan architectuur en laterale interacties tussen membraaneiwitten en synaps-specifieke geometrische beperkingen omvatten 3. Biochemische benaderingen zijn beperkt oplossend vermogen zij noodzakelijk verstoring van ten minste één van de synaptische membranen betrokken. Om deze reden werd een FRET-gebaseerde beeldvorming methodologie ontwikkeld om toezicht te houden binding van de TCR aan antigene pMHCs 2. Hier T-cellen zijn ingericht met een recombinant en plaatsspecifiek gelabeld TcR-reactieve enkele keten antilichaam fragment (SCF V) en geconfronteerd met plan AR-glas ondersteunde lipide bilagen (SLBs), die MHC klasse II-moleculen geladen met een fluorescent gelabeld antigeen peptide, co-stimulerende moleculen en adhesie-eiwitten haven. Synaptic binding tussen kleurstof gelabelde TCR en kleurstof-gelabelde pMHC resultaten in FRET die kunnen worden bewaakt bulk en één enkel molecuul van totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie.
In dit artikel wordt uitgelegd in detail hoe SLBs te gebruiken voor het testen van T-cel synapsen, controleren hun integriteit door middel van een functioneel T-cel calcium-flux test gedrag FRET metingen in bulk en met 'single molecule gevoeligheid, en de verkregen gegevens te analyseren. Aanbevelingen worden aangeboden aan het produceren van goed gelijkvormig eiwitten die nodig zijn voor tweelaags functionalisering. Voor meer specifieke informatie over dubbellaagsformatie en instellen van een geschikt TIRF microscoop wordt verwezen naar een extra toegang van het publiek Jupiter publicatie terug gepubliceerd aan rug 4.
tent "> Nature of SLBsFunctionalizable SLBs kunnen gemakkelijk worden gegenereerd van unilamellaire vesicles (SUV's) met de twee lipiden 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-gylcero-3-fosfocholine (afgekort POPC, 90-99%) en 1,2-dioleoyl- sn – glycero-3 – {[N- (5-amino-1-carboxypentyl) iminodiazijnzuur] succinyl} (afgekort DGS NTA-Ni, 1-10%). SUV's verspreid over schone glasplaatjes een aaneengesloten vlakke dubbellaag 4 vormen. DGS-NTA-Ni dient voor polyhistidine-gemerkte eiwitten anker via polyhistidine-gemedieerde complex-vorming met de synthetische NTA-Ni-bevattende kopgroep (Figuur 1A). Voor een stabiele vereniging één vervangt meestal de inheemse transmembraandomein en cytoplasmatische staart van de hechting eiwit ICAM-1 en de costimulatoire molecuul B7-1 met één tag bevat twaalf histidines (ICAM-1-12H, B7-1 -12H) (Figuur 1B) . De met peptide beladen klasse II molecule IE k bevat twee membraan ingebedde (α en β) polypeptideketens. De transmembraan / cytoplasmatische domeinen van beide ketens worden vervangen door een label met zes histidines elk (IE k α β 6H 6H of IE k -2x6H). Als alternatief verlenging van de α-keten met twaalf histidinen en verlaten van het extracellulaire domein van de β-keten ongemerkte (die tot IE k α β 12H 0H of IE k -12H) leidt tot bevredigende resultaten (Figuur 1B).
Site-specifieke etikettering van pMHCs
Het is belangrijk om de pMHC stoichiometrisch en plaatsspecifiek labelen om te kunnen meten FRET opbrengsten te zetten in betekenisvolle equilibrium bindingsconstanten. Dit kan worden bereikt door chemische labeling van een synthetisch peptide dat in de peptidebinding cleft van recombinant-histidine tag MHC klasse II moleculen 2,5 geladen. Het peptide omvat alle resten van de T-celepitoop als well als een korte C-terminale linker (GGS), gevolgd door cysteïne (bijvoorbeeld in de mot cytochroom c (MCC) peptide ANERADLIAYLKQATK- GGSC, de linker is vetgedrukt). Deze cysteïne wordt gebruikt om het peptide stoichiometrisch label met gebruik van maleimide-kleurstof derivaten. Op dit punt extra zorg moet worden besteed aan de controle van kwantitatieve dye-koppeling met de cysteïne bevattend peptide. HPLC-zuivering van het peptide-kleurstof adduct wordt aanbevolen en moet worden gevolgd door electrospray ionisatie massaspectroscopie. Elke opgenomen massa's die overeenkomen met het peptide educt (zonder kleurstof) weerspiegelen onvolledige labeling. Indien dit waar is, dient de HPLC-gezuiverde peptide wordt onderworpen aan achtereenvolgende ronden van dye-labeling tot labeling kwantitatieve geacht. Merk op dat MALDI-TOF massaspectroscopie moet worden vermeden omdat deze methode houdt laserstraling voor monster ionisatie. Deze behandeling desintegreert het bijgevoegde gevoelige fluoroforen voordat peptide massa wordt uitgelezen en dus underrepre woordigt graden van dye-vervoeging.
Indirect Nog plaatsspecifieke labeling van celgebonden TCRs met gebruik van monovalente enkele-keten Fv-fragmenten
Het is nog steeds een uitdaging om kleurstoffen oppervlak geassocieerde eiwitten van levende cellen cel in een plaatsspecifieke wijze bevestigen. Om deze hindernis voor oppervlak blootgestelde TCR overwinnen, is een monovalent enkele keten versie (SCF V) van de genen van de TcR -reactive monoklonale antilichaam H57-197 2 geconstrueerd. De kristalstructuur van dit antilichaam in complex met de TCR stelt om rationeel ontwerpen van een uitvoering, waarbij een serine residu in de nabijheid van de C-terminus van het MHC geassocieerde peptide (waarbij het overeenkomstige FRET partner kleurstof gehecht is) wordt vervangen door een cysteïnerest. Deze mutant cysteïne dient dan als een acceptor kleurstof conjugatie (figuur 2).
Methodologieën om FRET opnemen
nt "> Bulk FRET waarden best overeenstemt met de verhouding tussen gekozen inter-dye afstanden verifiëren en FRET efficiëntie gemeten in de TCR-pMHC bindsysteem 2. Bovendien bulk FRET metingen onthullen kwalitatieve en kwantitatieve verschillen in synaptische TCR-pMHC affiniteiten ( zie hieronder en protocol paragraaf 3.2). Verschillende benaderingen voor het kwantificeren van FRET efficiëntie hebben in de literatuur 6 geïntroduceerd. In dit artikel FRET wordt geregistreerd via(a) donor herstel na acceptor bleken, en via
(b) lichtgevoelig FRET acceptor emissie.
De eerste methode (a) vereist het gebruik van een FRET acceptor die gemakkelijk kan worden photobleached en een donor, die vrij photostable. Bovendien is het belangrijk dat de photobleached acceptor niet langer in staat afschrikken van het donor fluorescentie. Als dezelfde detectie-kanaal (donor) wordt gebruikt voor het kwantificeren, geen correctiefactoren eend geen chromatische aberraties moeten worden beschouwd, die deze methode eenvoudig en betrouwbaar maakt. Echter, kunnen kwantitatieve metingen niet worden herhaald op dezelfde plek monster en veranderingen in FRET kan niet worden opgenomen in de tijd. Effecten veroorzaakt door moleculaire diffusie of cellulaire beweeglijkheid snel bleken stap moet worden nagestreefd, waarbij de tijd passeren tussen de eerste FRET donor (vóór acceptor bleken) en de tweede FRET-donor beeldacquisitie (na FRET acceptor bleken) minimaliseert voorkomen. Het is aanbevolen om een krachtige laser lichtbron van de FRET acceptor excitatiegolflengte dienst om verlichting en bleken te minimaliseren.
In tegenstelling, in de benadering van FRET metingen gesensibiliseerde emissie (b) de FRET-donor geëxciteerd en de emissie van de acceptor FRET waargenomen in de FRET acceptor kanaal. Veranderingen in FRET acceptor signaal kan worden opgenomen in de tijd, maar de emissie van de FRET-donor in het rood-verschoven acceptor kanaal (termed bleedthrough) en FRET acceptor cross-excitatie via donor excitatie moet nauwkeurig worden bepaald en afgetrokken van de opgenomen FRET acceptor kanaal. Voor deze de overeenkomstige FRET donor en acceptor FRET beelden moeten ruimtelijk worden uitgelijnd.
Detectie van enkel molecuul (sm) FRET evenementen
Met het gebruik van lasers als excitatiebron, een gevoelige camera en ruis verzwakt TIRF microscopie van de fluorescentie van enkele fluoroforen gemakkelijk te traceren tijd. Soortgelijk geldt voor de detectie van intermoleculaire smFRET gebeurtenissen. Echter, kunnen complicaties worden veroorzaakt door FRET donor bleedthrough en cross-excitatie van de FRET acceptor, en derhalve grote zorg moet worden genomen bij het instellen van de fluorofoor dichtheden in de smFRET experiment.
In het protocol hieronder (protocol hoofdstuk 4) werd de TCR gekozen als FRET-donor in hoge overvloed en pMHC als FRET acceptor in lage overvloed. Naar FR verzwakkenET donor bleedthrough voldoende, versieren 10-30% van de TCR met fluorescerende SCF V en 90-70% van de TCR's met niet-fluorescerende SCF V. Hier werd de FRET acceptor kanaal gekozen als single molecule channel omdat het confocale met de single molecule FRET kanaal. Dit helpt om smFRET gebeurtenissen af te stemmen met 'single molecule FRET acceptoren, die de basis vormt van smFRET validatie.
Extraheren synaptische off-tarieven door middel smFRET metingen
Fotobleken van zowel FRET donor en acceptor FRET moeten worden verantwoord bij het uitpakken van de halfwaardetijd van interacties van single molecule FRET sporen. Het aantal waarneembare FRET-signalen aan het begin van hun verschijning als donor-acceptorpaar N (0) wordt de tijd verminderd zowel ontbinding van het receptor-ligand-complex en fotobleken. Het aantal overlevende complexen op een bepaald tijdstip N (t) kan mathematisch als volgt worden uitgedrukt:
<pDe term fotobleken exp (-t / τ bleekmiddel) het tijdstip t wordt beschreven door het product van het aantal waarnemingen n en de verlichtingstijd t slecht vanwege de niet-continue, discrete observatiemodus (dwz bleken uitsluitend tijdens de belichting ). Binnen de kinetische term exp- (t / τ uit) het tijdstip t is het product van het aantal waarnemingen n en de tijd t vertraging voor een FRET observatie (dwz kinetische ontbinding gebeurt continu). Vergelijking 1 kan worden uitgedrukt als:
De term τ bleekwater / τ ziek describes het aantal waarnemingen tot bleking optreedt en wordt gedefinieerd als de verwachtingswaarde <n bleken> van de exponentiële functie. Vergelijking 2 kan als volgt worden vereenvoudigd:
De verwachtingswaarde <n (t lag)> van het aantal frames N (t) met waar- FRET-gebeurtenissen na tijdstip t wordt rechtstreeks uit het experiment. Het hangt van de instelbare tijd tussen waarnemingen (t lag) in het experiment gekozen en de onbekende waarden τ uit (de inverse van de off-rate Koff) en <n bleken>, de verwachtingswaarde van het aantal waarnemingen voor het bleken optreedt .
Aldus berekening van de verwachtingswaarde <n (t lag)> ten minste twee waarden van t <sub> vertraging kan de experimentele bepaling van <n bleken> en r af.
Extraheren synaptische 2D-K D waarden door middel van FRET-gebaseerde metingen
Meten bezetting TCR a, dat wil zeggen de verhouding tussen gebonden TCR en de totale TCR is centraal bepalen synaptische 2D-KD-waarden. Volgens vergelijking 4 term is recht evenredig met de gemeten FRET verkregen zolang TCR dient als FRET donoren en acceptoren pMHCs als FRET.
met een bezetting = TCR, C = omrekeningsfactor
C is een constante die afhangt van het FRET-systeem en de gebruikte fluoroforen. Dit kan experimenteel worden bepaald zoals hieronder aangegeven. a kan worden omgezet in een 2D-K D volgens vergelijking 5 wanneer debegindichtheid van TCR liganden voorafgaand aan toevoeging van T-cellen aan de bilaag bekend. Dit is vanwege de hoge mobiliteit van SLB-verbonden eiwitten en omdat SLBs bieden een vrijwel onuitputtelijke reservoir van liganden 2.
met [pMHC oorspronkelijke] = aanvankelijke dichtheid van pMHC vóór de toevoeging van T-cellen
Vergelijkingen 4 en 5 kan nu gemakkelijk de synaptische 2D-KD tussen TCR en pMHC. Dit is het meest betrouwbaar gedaan met FRET metingen gebaseerd op donor herstel na acceptor bleken (zie protocol paragraaf 3.1).
Echter, het meten C de verhouding tussen de intensiteit I FRET FRET (gecorrigeerd voor achtergrond, FRET donor bleedthrough en FRET acceptor cross-excitatie) en TCR bezetting een te bepalen. Voor dit,moet weten de verhouding R tussen de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van enkele TCR-geassocieerde FRET donorfluoroforen (bijvoorbeeld Cy3 of AF555) sm Ik FRET donor en de gemiddelde intensiteit van de enkel molecuul FRET gebeurtenissen sm ik FRET. R is afhankelijk van het FRET-systeem betrokken emissie filters en camera voor fluorescentiedetectie.
De TCR een bezetting kan vervolgens direct worden bepaald volgens vergelijking 6.
met R = sm Ik FRET-donor / sm Ik FRET
R werd bepaald als 1,45 voor H57 scFv- Cy3 / Cy5 pMHC-systeem leidt tot:
a = bulk I FRET / bulk I TCR-Cy3 • 1,45
De relatie tussen de TCR een bezettingsgraad en FRET opbrengst kan worden bepaald door FRET donor herstelleny na acceptor bleken. Voor deze beide parameters uitgezet tegen elkaar om een aantal TCR microclusters zie figuur 4A .De helling van de lineaire fit geeft de conversiefactor C (met vergelijking 4).
Zoals aangetoond in Figuur 4A, C bedragen voor (a) het SCF H57 V – Cy3 / Cy5 pMHC-FRET-systeem en (b) de toegepaste configuratie microscoopsysteem aan 1,995. De TCR bezetting een gemakkelijk als volgt worden afgeleid:
TCR bezetting a = FRET opleveren • 1,995
Meten van eiwit-eiwit interacties in situ zeer gewenst vooral dan wanneer het lage affiniteit interacties zoals TCR-pMHC-bindende 11. Dit is omdat de aan-snelheid en de stabiliteit van dergelijke interacties significant beïnvloed door de bijzondere omstandigheden waarin binding plaatsvindt. Minimaal-invasieve-FRET gebaseerde beeldvorming benaderingen zijn dus in principe perfect geschikt voor dergelijke taken, maar omvatten een aantal hindernissen die eerst moeten worden overwonnen. Geluid van cellulaire autofluorescentie beperkt de gevoeligheid van de metingen en derhalve tot een minimum worden beperkt. TIRF microscopie dient deze behoefte goed 12 maar vereist de functionalisering van glazen objectglaasjes, bij voorkeur in de vorm van een vlakke glazen ondersteunde lipide dubbellaag ingericht eiwitten keuze 13-15. Een ander voordeel van een gedeeltelijk reconstitutive aanpak is dat recombinant tweelaags-resident FRET partners veel m kan zijnerts gemakkelijk geëtiketteerd kwantitatief, plaatsspecifieke en rationele wijze met kleiner en lichter fluoroforen dan mogelijk zou zijn met celoppervlak eiwitten. TCR's worden gelabeld met recombinant SCF Vs, die geen invloed T-cel herkenning, zoals hiervoor 2 getest. Bovendien is de eiwitsamenstelling van de SLB, bijvoorbeeld de dichtheid van pMHCs en de keuze van accessoire factoren kan worden aangepast aan de eigen behoeften. We hebben eerder uitgevoerde experimenten met verschillende dichtheden van stimulerende pMHCs, maar significante verschillen in 2D-k off en 2D-K D 2 niet hebben ontdekt.
Zo ver hier de erkenning van MHC klasse II moleculen is behandeld slechts, vooral vanwege de aard van hun peptidebinding spleet, die aan beide uiteinden open is en biedt dus grotere peptiden met een linker voor fluorofoor bevestiging. In sommige gevallen kan een dergelijke aanpak ook werken voor de etikettering MHC class I moleculen 16 maar grote voorzichtigheid moeten worden genomen om het gebruik ervan in experimenten te controleren. De gevoeligheid van T-cellen aan antigenen die kunnen worden gemeten via T-celproliferatiebepalingen, evenals het pMHC-TCR bindingskinetiek zoals in vitro gemeten door oppervlakte plasmon resonantie niet worden beïnvloed door de toevoeging van de linker en fluorofoor het peptide. Alternatief MHC klasse I moleculen zelf kan worden in een plaatsspecifieke wijze met de introductie van een ongepaard cysteïne binnen de sequentie van de zware keten (ongepubliceerde observaties) gemerkt.
Bij het gebruik van geschikte moleculaire probes elk synaptisch eiwit-eiwit interacties kunnen in principe worden onderzocht op een wijze die hierin is beschreven. Dergelijke sondes, bijvoorbeeld, moet SCF V s of Ontworpen Ankyrine Herhaal Eiwitten (DARPins) 17, monovalent en moeten hun doelgroep stabiel zonder dat de interactie van belang te binden. Natuurlijk structurele information is zeer wenselijk voor rationeel ontwerp probe maar niet absoluut noodzakelijk. Bij de oprichting van een nieuw paar FRET partners, is het raadzaam om op te nemen en te analyseren FRET in bulk als eerste. Sites van label bevestiging kan aanzienlijk worden gevarieerd om de FRET signaal te maximaliseren en ook om te verifiëren dat gemeten FRET rendementen verschillen op basis van de inter-dye afstand. Zodra het systeem is geoptimaliseerd, enkel molecuul FRET-signalen kunnen worden opgenomen door de etikettering van de hoge overvloed FRET partner te beperken tot 10-30% en bleken de lage overvloed FRET partner tot enkele moleculen oplosbaar zijn op het gebied van verlichting.
Tenslotte zij opgemerkt dat SLBs benadering sommige maar niet alle aspecten van fysiologische plasmamembraan. Eigenschappen zoals membraan kromming en flexibiliteit domein compartimentering, herschikkingen van het cytoskelet en celmotiliteit en grote variëteit oppervlak tot expressie membraaneiwitten zijn die niet door SLBs maar zou t beïnvloedenhij verwerken in onderzoek. Veel inspanning zal moeten worden geïnvesteerd om beeldvormende technieken die het mogelijk maken de controle op eiwit-eiwit-interacties met 'single molecule resolutie in fysiologische synapsen, die niet toegankelijk zijn voor TIRF beeldvorming zijn vast te stellen.
The authors have nothing to disclose.
MA werd ondersteund door een Schrödinger gemeenschap van de Oostenrijkse Science Fonds (FWF, J3086-B11) en dankzij het Max-Planck-Maatschappij voor financiële en administratieve ondersteuning. GS en JH werden ondersteund door de Wenen Science and Technology Fund (WWTF, LS13-030).
LB-media | Fisher Scientific | 10000713 | bacterial expression |
Sf900 II | Life Technologies | 10227402 | insect cell media for baculo virus production |
Insect-XPRESS with L-glutamine (Lonza) | Fisher Scientific | 10564038 | insect cell media for baculo virus expression |
Sf9 cells | Life Technologies | 11496-015 | cells for virus production and expansion |
High Five Cells | Life Technologies | B855-02 | cells for potein expression |
LB-media | Fisher Scientific | 10000713 | bacterial expression |
Centramate System | Pall | protein concentartion from large volumes | |
Centramate cassette 10kDa cutoff | Pall | OS010T12 | protein concentartion from large volumes |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | EMD Millipore | UFC900308 | protein concentartion |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units | EMD Millipore | UFC800308 | protein concentartion |
Amicon Stirred Ultrafiltration Cell Model 200 mL | EMD Millipore | 5123 | protein concentartion |
Äkta pure 25L | GE Healthcare | 29-0182-24 | protein purification |
Superdex 200 10/300 GL | GE Healthcare | 17-5175-01 | protein purification |
Superdex 75 10/300 GL | GE Healthcare | 17-5174-01 | protein purification |
Mono Q 5/50GL | GE Healthcare | 17-5166-01 | protein purification |
Ni Sepharose 6 Fast Flow | GE Healthcare | 17-5318-01 | protein purification |
Tricorn 10/20 column | GE Healthcare | 28-4064-13 | protein purification |
Gilson HPLC system | Gilson | purificationof fluorochrome-coupled peptides | |
Pursuit XRs C18, 5 µm particle size, 21.2*250mm column size | Agilent | A6000250X212 | purificationof fluorochrome-coupled peptides |
Pursuit XRs C18, 5 µm particle size, 21.2*50 mm column size | Agilent | A6000050G212 | purificationof fluorochrome-coupled peptides |
Tricorn 10/20 column | GE Healthcare | 28-4064-13 | protein purification |
Gilson HPLC system | Gilson | purificationof fluorochrome-coupled peptides | |
Pursuit XRs C18, 5 µm particle size, 21.2*250mm column size | Agilent | A6000250X212 | purificationof fluorochrome-coupled peptides |
Pursuit XRs C18, 5 µm particle size, 21.2*50 mm column size | Agilent | A6000050G212 | purificationof fluorochrome-coupled peptides |
Cy3 maleimide | GE Healthcare | PA23031 | site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines |
Cy5 maleimide | GE Healthcare | PA25031 | site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines |
Alexa Fluor 555 C2 Maleimide | Life Technologies | A-20346 | site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines |
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide | Life Technologies | A-20347 | site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines |
Fura-2, AM, cell permeant | Life Technologies | F-1221 | calcium-sensitive dye for cell labeling |
dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | 151874 | for dissolving fura-2 am |
Hank's Balanced Salt Solution plus calcium/magnesium | Fisher Scientific | 10225362 | imaging buffer |
PBS | Life Technologies | 14190-136 | |
Bovine Serum Albumin lyophilized powder | Sigma Aldrich | A2153 | supplement for imaging buffer |
14-4-4S antibody | affimetrix eBioscience | 14-5980-81 | blocking antibody for H2-I-Ek (recognized by the 5c.c7, 2B4 and AND TCR) |
5 ml polypropylene round-bottom tube | Becton Dickinson | FALCON 352063 | |
0.22 μm Ultrafree-MC centrifugal filter unit | EMD Millipore | UFC30GV0S | |
Syringe filter 0.2µm | Millipore | GVWP04700 | |
TetraSpeck Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red | Life technologies | T-7279 | |
Microscope for fura-2-based calcium measurements | LEICA | DMI4000B | |
Microscope for (single molecule) FRET measurements | LEICA/ZEISS/NIKON/OLYMPUS | for details please refer to parallel JoVE contribution by Axmann et al. | |
planar supported lipid bilayers | for details please refer to parallel JoVE contribution by Axmann et al. | ||
RPMI 1640, with L-Glutamine | Life Technologies | 11554416 | T-cell media |
non-essential amino acid 100X | Hyclone | SH30238.01 | T-cell media supplement |
penicillin/streptomycin/L-glutamine 100x | Life Technologies | 12000226 | T-cell media supplement |
2-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | T-cell media supplement |
mouse interleukin-2 recombinant protein | BPS Bioscience | 90185-B | T-cell media supplement |
Research Grade Fetal Bovine Serum | Hyclone | SV30160.03 | T-cell media supplement |
Origin (analysis program) | OrigenLab | http://www.originlab.com/ | non-linear fitting of two parameters (tauoff, [ntlag]) |