This manuscript describes how to conduct (single molecule) Förster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer.
T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen Presenting Cells (APCs). This is despite T-cell antigen receptors (TCRs) exerting usually a moderate affinity (µM range) to antigen when binding is measured in vitro1. In view of the molecular and cellular parameters contributing to T-cell antigen sensitivity, a microscopy-based methodology has been developed as a means to monitor TCR-pMHC binding in situ, as it occurs within the synapse of a live T-cell and an artificial and functionalized glass-supported planar lipid bilayer (SLB), which mimics the cell membrane of an Antigen presenting Cell (APC) 2. Measurements are based on Förster Resonance Energy Transfer (FRET) between a blue- and red-shifted fluorescent dye attached to the TCR and the pMHC. Because the efficiency of FRET is inversely proportional to the sixth power of the inter-dye distance, one can employ FRET signals to visualize synaptic TCR-pMHC binding. The sensitive of the microscopy approach supports detection of single molecule FRET events. This allows to determine the affinity and off-rate of synaptic TCR-pMHC interactions and in turn to interpolate the on-rate of binding. Analogous assays could be applied to measure other receptor-ligand interactions in their native environment.
Uma compreensão mais fundamental de como as células T reconhecem os antígenos requer olhar para o lugar certo, ou seja, dentro da sinapse imunológica formado entre a célula T e do APC. Aqui, a cinética de ligação molecular não são apenas determinadas pelas propriedades bioquímicas intrínsecas dos parceiros de interacção envolvidos, mas dependem em grande medida dos parâmetros celulares, que incluem forças celulares, a arquitectura da membrana e das interacções laterais entre as proteínas da membrana, bem como as restrições geométricas específicas da sinapse 3. Abordagens bioquímicas são limitados em potência de resolução como eles exigem a disrupção de, pelo menos, uma das membranas sinápticas envolvidas. Por esta razão, uma metodologia de imagem baseados em FRET foi desenvolvido para monitorar a ligação do TCR para pMHCs antigênicas 2. Aqui as células T são decorados com um recombinante e de site especificamente rotulado TCRβ-reativa de cadeia simples fragmento de anticorpo (SCF V) e confrontados com plano AR bicamadas lipídicas suportada em vidro (SLBS), que abrigam as moléculas MHC de classe II carregadas com um péptido antigénico marcado por fluorescência, moléculas co-estimulatórias e proteínas de adesão. Synaptic ligação entre TCR e corante marcado marcadas com corante de resultados pMHC em FRET, que podem ser monitorados em um único volume e nível molécula pela Total Internal Reflection fluorescência microscopia (TIRF).
Neste artigo é explicado em detalhe como utilizar SLBS para ensaiar sinapses das células T, verificar sua integridade através de um ensaio de cálcio-flux de células T funcional, conduta FRET medições a granel e com sensibilidade única molécula, e analisar os dados adquiridos. Recomendações são oferecidas para a produção de proteínas adequadamente conformado necessários para bicamada funcionalização. Para obter informações mais específicas sobre a formação de bicamada e configuração de um microscópio TIRF adequado, consulte a uma publicação JoVE acesso público adicional publicada volta para trás 4.
tenda "> Nature de SLBSSLBS functionalizable pode ser prontamente gerado a partir de vesículas unilamelares (SUVs) que contém os dois lípidos 1-palmitoil-2-oleoil-sn-gylcero-3-fosfocolina (curto: POPC, 90-99%) e 1,2-sn dioleoyl- – glicero-3 – {[N- (5-amino-1-carboxipentil) ácido iminodiacético] succinil} (curto: DGS NTA-Ni, 1-10%). SUVs, distribuídos em lâminas de vidro limpas para formar uma bicamada planar contígua 4. DGS-NTA-Ni serve para ancorar proteínas marcadas com poli-histidina-complexo através de formação mediada por poli-histidina, com o NTA-Ni que contém um grupo de cabeça (Figura 1A) sintético. Para uma associação estável substitui tipicamente o domínio transmembranar e a cauda citoplasmática nativa da proteína de adesão ICAM-1 e a molécula co-estimuladora B7-1 com uma etiqueta contendo doze histidinas (ICAM-1-12H, -12H B7-1) (Figura 1B) . O péptido carregado-classe II K IE molécula contém duas cadeias polipéptido incorporado-membrana (α e β)s. Os transmembranares / domínios citoplásmicos de ambas as cadeias têm que ser substituídos com uma etiqueta de seis histidinas contendo cada (IE k α 6H β 6H k -2x6H ou IE). Como uma alternativa, que se prolonga a cadeia com doze α histidinas e deixando o domínio extracelular da cadeia β não marcado (dando origem a IE k α 0H 12H β ou IE k -12H) dá origem a resultados satisfatórios (Figura 1B).
Rotulagem específica do local de pMHCs
É importante para marcar o local e pMHC estequiometricamente-especificamente, a fim de ser capaz de converter os rendimentos medidos em FRET constantes de ligação de equilíbrio significativas. Isto pode ser conseguido pela marcação química de um péptido sintético que é carregado para a fenda de ligação ao péptido de recombinante marcada com histidina moléculas MHC de classe II 2,5. O péptido inclui todos os resíduos do epitopo de célula T como well como um curto C-terminal ligante (GGS) seguido por cisteína (por exemplo, a traça do citocromo c (MCC) péptido ANERADLIAYLKQATK- GGSC, o ligante é marcado em negrito). Esta cisteína é utilizado para marcar o péptido estequiometricamente com o uso de derivados de maleimida com corante. Neste ponto, cuidado extra deve ser dedicada à verificação quantitativa corante de acoplamento para o peptídeo contendo cisteína. HPLC de purificação do aducto de péptido-corante é recomendado e deve ser seguido por espectroscopia de massa por ionização por electropulverização. Quaisquer massas gravados correspondentes ao educto peptídeo (sem corante) refletem rotulagem incompleta. Se isto é verdade, o péptido purificado por HPLC-deve ser submetido a ciclos consecutivos de-marcação com corante até que a rotulagem é considerada quantitativa. Note-se que a espectroscopia de massa MALDI-TOF deve ser evitada dado que este método envolve a radiação laser para uma amostra de ionização. Este tratamento se desintegra as fluorophores sensíveis ligados antes de massa peptídeo é lido e, portanto, underrepre graus Sents de dye-conjugação.
Ainda marcação indirecta do local específico de TCR ligado de células com a utilização de fragmentos de cadeia simples Fv monovalente
Ele ainda é um desafio para anexar corantes para celular proteínas associadas à superfície de células vivas de uma maneira específica do local. Para superar este obstáculo para TCRs expostos à superfície, uma versão monovalente de cadeia única (scFv) a partir dos genes do anticorpo monoclonal TCRβ Reativo H57-197 2 foi construído. A estrutura cristalina deste anticorpo em complexo com o TCR permite conceber racionalmente uma versão, na qual um resíduo de serina em estreita proximidade com o terminal C do péptido associado MHC (em que o corante parceiro de FRET correspondente está ligado) é substituído por um resíduo de cisteína. Este mutante de cisteína, em seguida, serve como um aceitador para a conjugação de corantes (Figura 2).
Metodologias para gravar FRET
nt "> valores FRET em massa são os mais adequados para verificar a relação entre as distâncias inter-dye escolhidos e FRET eficiências medidos neste TCR-pMHC sistema 2 vinculativa. Além disso, as medições FRET granel revelar diferenças qualitativas e quantitativas na sinápticas afinidades TCR-pMHC ( ver abaixo e secção protocolo 3.2). Várias abordagens para quantificar a eficiência FRET foram introduzidos na literatura 6. Neste artigo é registada por meio de FRET(a) doador recuperação após aceitante de branqueamento, e via
(b) emissão de aceitador FRET sensibilizados.
O primeiro método (a) exige a utilização de um aceitador FRET que pode ser facilmente Foto-descoloração, e um doador, a qual é bastante fotoestável. Além disso, é importante assegurar que o aceitador de Foto-descoloração não é mais capaz de extinguir a fluorescência do dador. À medida que o mesmo canal de detecção (doador) é usado para a quantificação, sem factores de correcção umd há aberrações cromáticas devem ser considerados, o que torna esta metodologia simples e confiável. No entanto, as medidas quantitativas não pode ser repetida no mesmo local de amostra e mudanças na FRET não podem ser gravadas ao longo do tempo. Para evitar efeitos causados pela difusão molecular ou motilidade celular um passo de branqueamento rápido deve ser orientado para, o que minimiza o tempo que passa entre o primeiro doador FRET (antes receptor de branqueamento) e a segunda aquisição de imagens FRET doador (depois de FRET receptor de branqueamento). É recomendado empregar uma poderosa fonte de luz laser do comprimento de onda de excitação aceitador FRET, a fim de minimizar a iluminação e de branqueamento vezes.
Em contraste, na abordagem da medição das emissões de FRET sensibilizado (b) o dador FRET é animado e a emissão do aceitador FRET é observado no canal aceitador FRET. Alterações na sinal aceitador FRET pode ser gravado, mas ao longo do tempo de emissão do doador FRET para o canal receptor vermelho-deslocada (termed exsudação) e FRET aceitante cross-excitação via doador excitação tem que ser determinado com exactidão e subtraído do canal receptor de FRET gravado. Para isso as imagens correspondentes aceitador FRET doador e traste tem que ser espacialmente alinhados.
A detecção de única molécula (sm) FRET eventos
Com o uso de lasers como fonte de excitação, uma câmara sensível e microscopia TIRF-ruído atenuado a fluorescência de fluoróforos individuais podem ser facilmente rastreada ao longo do tempo. Semelhante é verdadeiro para a detecção de eventos smFRET intermoleculares. No entanto, as complicações podem ser causados por FRET exsudação dador e trans-excitação do aceitador FRET, e, assim, grande cuidado deve ser tomado ao ajustar as densidades fluoróforo na experiência smFRET.
No protocolo fornecido abaixo (seção de protocolo 4) a TCR foi escolhido como FRET doadores em alta abundância e pMHC como FRET aceitante em baixa abundância. Para atenuar FRET doador suficientemente exsudação, decorar 10-30% dos TCRs com FCE fluorescente V e 90-70% dos TCRs com FCE não fluorescente V. Aqui, o canal de aceitador FRET foi escolhido como único canal molécula porque é confocal com a única molécula FRET canal. Isto ajuda a alinhar com eventos smFRET molécula única aceitadores de FRET, que é a base de validação smFRET.
Extraindo-off taxas sinápticas através de medições smFRET
Fotodegradação de ambos FRET doador e receptor FRET tem que ser contabilizado ao extrair a meia-vida de interações de única molécula FRET vestígios. O número de sinais observáveis FRET no início da sua aparência como par dador-aceitador individuais n (0) é reduzido ao longo do tempo, tanto unbinding do fotobranqueamento e complexo ligando-receptor. O número de sobreviventes complexos num dado momento N (t) pode ser expresso matematicamente como se segue:
<p class = "jove_content">No termo fotobranqueamento exp (-t / τ lixívia) o tempo t é descrita pelo produto do número de observações N e o tempo de iluminação t mal por causa da observação de modo não-contínua, discreta (isto é, de branqueamento ocorre apenas durante a iluminação ). Dentro do termo cinética exp- (t / τ desligado) o tempo t é o produto do número de observações n e t o intervalo de tempo para uma única observação FRET (isto é, acontece continuamente unbinding cinética). Equação 1 pode ser expressa como:
O termo τ lixívia / τ doente describes o número de observações até branqueamento ocorre e é definido como o valor esperado <n branquear> da sua função exponencial. A equação 2 pode ser simplificada, como se segue:
O valor esperado <N (t lag)> do número de quadros de N (t) com FRET eventos observáveis após o tempo t é determinado directamente a partir da experiência. Depende do tempo ajustável entre as observações (t lag) escolhidos no experimento e os valores desconhecidos para τ off (o inverso da taxa de off k off) e <n branquear>, o valor esperado do número de observações antes de ocorrer branqueamento .
Assim, o cálculo do valor esperado <N (t lag)> para, pelo menos, dois valores de t <sub> lag permite a determinação experimental de <n branquear> e τ off.
Extraindo valores sinápticas 2D-K D através de medições baseadas em FRET
Medindo uma ocupação de TCR, isto é, a razão entre os TCRs e ligados no total TCR, é fundamental para a determinação dos valores de K-sinápticos 2D d. De acordo com a equação 4 este termo é directamente proporcional à medida FRET produzir TCR, desde que serve como dadores e aceitantes pMHCs como FRET FRET.
com uma ocupação = TCR, C = fator de conversão
C é uma constante, que depende do sistema de FRET e os fluoróforos utilizado. Ele pode ser determinado experimentalmente, conforme mostrado abaixo. um pode ser convertido num 2D-K D de acordo com a equação 5, quando odensidade inicial de ligandos de TCR, antes da adição de células T para a bicamada é conhecido. Isto é devido à grande mobilidade das proteínas SLB-inscritos e também porque SLBS fornecer um reservatório quase inesgotável de ligantes 2.
com [pMHC inicial] = densidade inicial de pMHC antes da adição de células T
Com equações 4 e 5 pode-se agora facilmente determinar o sináptica 2D-K D entre TCR e pMHC. Isso é feito mais com medições FRET com base na recuperação de doadores após o clareamento receptor (ver seção de protocolo 3.1).
No entanto, à medida C a relação entre a intensidade de FRET FRET I (corrigido para o fundo, de FRET exsudação dador e aceitador FRET cruzada excitação) e TCR ocupação um tem de ser determinado. Para isso, umaprecisa de saber a relação R entre a intensidade média de fluorescência de fluoróforos individuais TCR-associados FRET doadores (por exemplo, Cy3 ou AF555) sm I doador FRET e a intensidade média de molécula única FRET FRET I sm eventos. R depende do sistema de FRET em questão, e filtros de emissão de câmara utilizada para a detecção de fluorescência.
A ocupação de um TCR pode então ser determinado directamente de acordo com a equação 6.
com R = sm I FRET doador / sm I FRET
R foi determinado como 1,45 para o sistema de scFv H57 Cy3 / pMHC-Cy5 leva a:
a = massa I FRET / bulk I TCR-cy3 • 1,45
A relação entre a ocupação de TCR a e o rendimento de FRET pode ser determinado por doador FRET recuperary aceitador após branqueamento. Para esta dois parâmetros são representados graficamente contra o outro para um número de TCR microclusters como mostrado na Figura 4A .A inclinação do ajuste linear indica o factor de conversão C (a partir da equação 4).
Como demonstrado na Figura 4A, C ascende para (a) o V H57 scF – Cy3 / pMHC-Cy5 sistema FRET e (b) a configuração do sistema de microscópio aplicado a 1.995. A ocupação de um TCR pode ser facilmente deduzido da seguinte forma:
A ocupação de um TCR = FRET produzir 1,995 •
Medição de interacções proteína-proteína in situ é altamente desejável, especialmente quando se lida com as interacções de baixa afinidade, tais como ligação de TCR-pMHC 11. Isto é porque a taxa de sobre-, bem como a estabilidade de tais interacções são significativamente influenciadas pelas circunstâncias particulares sob as quais ligação ocorre. Abordagens de imagem baseados em FRET minimamente invasivos são, portanto, em princípio, perfeitamente adequado para tais tarefas, ainda envolver uma série de obstáculos que devem ser superados primeiro. O ruído gerado por autofluorescência celular limita a sensibilidade das medidas e deve, portanto, ser mantidos a um mínimo. Microscopia TIRF serve essa necessidade muito bem 12, mas exige a funcionalização de vidro-slides, idealmente sob a forma de uma bicamada lipídica planar suportada em vidro decorado com proteínas de escolha 13-15. Outra vantagem de uma abordagem que é parcialmente reconstitutive parceiros FRET recombinantes bicamada residente pode ser muito mminério facilmente marcada em um, local específico forma quantitativa e racional com fluoróforos menores e mais brilhantes do que seria possível com proteínas expressas na superfície de células. TCRs são marcados com scFv recombinante s, que não influenciam o reconhecimento de células T, como foi anteriormente testada 2. Além disso, a composição de proteína do SLB, por exemplo, a densidade de pMHCs e a escolha dos factores de acessório pode ser ajustado para a necessidades específicas. Temos experiências previamente realizada com diferentes densidades de pMHCs estimulantes, mas não detectaram diferenças significativas em 2D-koff e 2D-K D 2.
Até agora aqui o reconhecimento de moléculas do MHC da classe II tem sido tratado com apenas, principalmente por causa da natureza da sua fenda de ligação peptídeo, que é aberto em ambas as extremidades e, assim, acomoda péptidos maiores, incluindo um ligante para a fixação fluoróforo. Em alguns casos, esta abordagem pode também trabalhar para a rotulagem MHC class I moléculas 16, mas grande cuidado deve ser tomado para verificar a sua utilização em experiências. A sensibilidade das células T contra os antigénios, os quais podem ser medidos através de ensaios de proliferação de células T, assim como a cinética de ligação pMHC-TCR tal como medido in vitro por ressonância de plasma de superfície não deve ser afectada pela adição do ligante e fluoróforo para o péptido. Alternativamente, MHC de classe I próprias moléculas podem ser marcados de uma maneira específica do local, com a introdução de uma cisteína não emparelhado no interior da sequência da cadeia pesada (observações não publicadas).
Com a utilização de sondas moleculares apropriados qualquer interacção proteína-proteína sináptica pode, em princípio, ser estudados de uma forma aqui descrita. Essas sondas, por exemplo, Proteínas Projetado Ankyrin Repetir (DARPins) 17, a SCF V s ou deveria ser monovalente e deve vincular seu alvo de forma estável, sem afetar a interação de interesse. Claro, informatio estruturaln é altamente desejável para a concepção racional de sonda, mas não absolutamente necessário. Ao estabelecer um novo par de FRET parceiros, recomenda-se para gravar e analisar FRET em grandes quantidades em primeiro lugar. Locais de ligação da etiqueta pode variar consideravelmente para maximizar o sinal de FRET e também para verificar que os rendimentos medidos FRET variar em função da distância inter-corante. Uma vez que o sistema é otimizado, única molécula FRET sinais podem ser gravados através da limitação da rotulagem do FRET parceiro alta abundância de 10-30% e branqueamento da FRET parceiro baixa abundância até moléculas individuais são resolvidos no campo da iluminação.
Por último, mas não menos importante, deverá ser notado que SLBS aproximar alguns, mas não todos os aspectos da membrana plasmática fisiológico. Qualidades tais como curvatura da membrana e flexibilidade, domínio compartimentalização, rearranjos do citoesqueleto e a motilidade celular, bem como uma elevada variedade de proteínas de membrana de superfície não-expressos são representados por SLBS mas pode influenciar tele processar sob investigação. Muito esforço terá de ser investido para estabelecer modalidades de imagem que permitem a monitorização interações proteína-proteína com resolução molécula única em sinapses fisiológicas, que são inacessíveis a imagem TIRF.
The authors have nothing to disclose.
MA foi apoiado por uma bolsa de Schrödinger do Fundo austríaco Science (FWF, J3086-B11) e graças a Max-Planck-Sociedade de apoio financeiro e administrativo. GS e JH foram apoiados pelo Fundo de Ciência e Tecnologia de Viena (WWTF, LS13-030).
LB-media | Fisher Scientific | 10000713 | bacterial expression |
Sf900 II | Life Technologies | 10227402 | insect cell media for baculo virus production |
Insect-XPRESS with L-glutamine (Lonza) | Fisher Scientific | 10564038 | insect cell media for baculo virus expression |
Sf9 cells | Life Technologies | 11496-015 | cells for virus production and expansion |
High Five Cells | Life Technologies | B855-02 | cells for potein expression |
LB-media | Fisher Scientific | 10000713 | bacterial expression |
Centramate System | Pall | protein concentartion from large volumes | |
Centramate cassette 10kDa cutoff | Pall | OS010T12 | protein concentartion from large volumes |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | EMD Millipore | UFC900308 | protein concentartion |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units | EMD Millipore | UFC800308 | protein concentartion |
Amicon Stirred Ultrafiltration Cell Model 200 mL | EMD Millipore | 5123 | protein concentartion |
Äkta pure 25L | GE Healthcare | 29-0182-24 | protein purification |
Superdex 200 10/300 GL | GE Healthcare | 17-5175-01 | protein purification |
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Mono Q 5/50GL | GE Healthcare | 17-5166-01 | protein purification |
Ni Sepharose 6 Fast Flow | GE Healthcare | 17-5318-01 | protein purification |
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Cy3 maleimide | GE Healthcare | PA23031 | site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines |
Cy5 maleimide | GE Healthcare | PA25031 | site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines |
Alexa Fluor 555 C2 Maleimide | Life Technologies | A-20346 | site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines |
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide | Life Technologies | A-20347 | site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines |
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TetraSpeck Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red | Life technologies | T-7279 | |
Microscope for fura-2-based calcium measurements | LEICA | DMI4000B | |
Microscope for (single molecule) FRET measurements | LEICA/ZEISS/NIKON/OLYMPUS | for details please refer to parallel JoVE contribution by Axmann et al. | |
planar supported lipid bilayers | for details please refer to parallel JoVE contribution by Axmann et al. | ||
RPMI 1640, with L-Glutamine | Life Technologies | 11554416 | T-cell media |
non-essential amino acid 100X | Hyclone | SH30238.01 | T-cell media supplement |
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Research Grade Fetal Bovine Serum | Hyclone | SV30160.03 | T-cell media supplement |
Origin (analysis program) | OrigenLab | http://www.originlab.com/ | non-linear fitting of two parameters (tauoff, [ntlag]) |