Summary

Analyse von<em> Yersinia enterocolitica</em> Effektor Translokation in Wirtszellen unter Verwendung Beta-Lactamase-Effektor-Fusionen

Published: October 13, 2015
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Summary

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

Abstract

Viele gramnegative Bakterien einschließlich pathogenen Yersinia spp. Beschäftigen Typ III-Sekretion Systeme Effektorproteinen in eukaryontische Zielzellen zu translozieren. Im Inneren der Wirtszelle die Effektor-Proteine ​​zu manipulieren zellulären Funktionen zum Vorteil der Bakterien. Um die Kontrolle des Typ III-Sekretion während der Host-Zell-Interaktion, empfindliche und genaue Tests besser zu verstehen, um die Translokation zu messen sind erforderlich. Wir beschreiben hier die Anwendung eines Assays auf der Basis der Fusion einer Yersinia enterocolitica Effektorprotein Fragment (Yersinia Außen Protein; YopE). TEM-1-Beta-Lactamase für eine quantitative Analyse der Translokation Der Assay beruht auf der Spaltung einer Zelle permeant FRET-Farbstoff (CCF4 / AM) durch transloziert Beta-Lactamase-Fusion. Nach der Spaltung des Cephalosporins Kern CCF4 durch die Beta-Lactamase, FRET von Cumarin zu Fluorescein ist gestört und Anregung der Kumarin-Gruppe führt zu blauen Fluoreszenzemission.Verschiedene Anwendungen dieses Verfahrens sind in der Literatur Hervorhebung ihrer Vielseitigkeit beschrieben. Das Verfahren erlaubt die Analyse der Translokation in vitro als auch in vivo, zB in einem Maus-Modell. Detektion der Fluoreszenzsignale kann unter Verwendung von Plattenleser, FACS-Analyse oder Fluoreszenzmikroskopie werden. In der hier von verschiedenen Yersinia Mutanten beschrieben, in vitro Translokation von Effektor-Fusionen in HeLa-Zellen-Setup wird durch Laser Scanning Mikroskopie überwacht. Aufzeichnung intrazellulären Umwandlung des FRET-Reporter durch die Beta-Lactamase-Effektor-Fusion in Echtzeit bietet robuste quantitative Ergebnisse. Wir zeigen hier beispielhafte Daten, was zeigt, erhöhte Translokation von einem Y. enterocolitica YopE Mutante im Vergleich zum Wildtyp-Stamm.

Introduction

Typ III-Sekretion Systeme sind von verschiedenen spezialisierten Genera gram-negativer Bakterien, direkt liefern bakteriell kodierte Effektorproteinen in eukaryontische Zielzellen genutzt Protein-Export-Maschinen. Während die Sekretion Maschine selbst ist hoch konserviert, haben spezialisierte Gruppen von Effektorproteinen zwischen den verschiedenen Bakterienarten entwickelt, um Signale der Zelle verändern und erleichtern bestimmten bakteriellen Virulenz-Strategien ein. Im Falle von Yersinia, bis zu sieben Effektorproteine ​​sogenannte Yops (Yersinia äußeren Proteine), werden bei Wirtszelle Kontakt transloziert und wirken zusammen, um die Immunzellantworten, wie Phagozytose und die Cytokin-Produktion, dh wandern, um extrazelluläre Überleben der Bakterien erlauben 2-4. Der Prozess der Translokation ist eng in den verschiedenen Phasen 5 gesteuert. Es ist erwiesen, dass die primäre Aktivierung des T3SS durch seinen Kontakt mit dem Ziel ce ausgelöstll 6. Jedoch ist der genaue Mechanismus dieser Einleitung noch aufgeklärt werden. Yersinia in eine zweite Ebene von sogenannten Feinabstimmung der Translokation durch Aufwärts- oder Abwärtsregulierende Aktivität der zellulären Rho GTP-bindenden Proteinen Rac1 oder RhoA erreicht. Aktivierung von Rac1 zB durch Invasindomäne oder zytotoxische nekrotisierende Faktor Y (CNF-Y) führt zu einer erhöhten Translokation 7-9, während die GAP (GTPase-aktivierendes Protein) Funktion transloziert YopE herunterreguliert Rac1-Aktivität und dementsprechend verringert sich die Translokation durch eine negative Rückkopplung der Mechanismus 10,11.

Gültig und präzise Methoden sind die Voraussetzung, um zu untersuchen, wie die Translokation bei Yersinia Wirtszellinteraktion wird geregelt. Viele verschiedene Systeme wurden für diesen Zweck mit spezifischen Vor- und Nachteile gelegt, wobei jeder. Einige Ansätze beruhen auf der Lyse von infizierten Zellen, nicht aber Bakterien durch verschiedene Reinigungsmittel, gefolgt von Western-Blot-Analyse. The gemeinsamer Nachteil dieser Verfahren ist, dass geringfügige, aber unvermeidliche Bakterienlyse potentiell verunreinigt das Zelllysat mit Bakterien-assoziierten Effektor-Proteine. Die Behandlung der Zellen mit Proteinase K, um extrazelluläre Effektorproteine ​​und die anschließende Verwendung von Digitonin zur selektiven Lyse der eukaryotischen Zellen abgebaut wurden vorgeschlagen, um dieses Problem zu 12 zu minimieren. Wichtig ist, dass diese Assays entscheidend davon abhängen, hochwertige Anti-Effektor-Antikörper, die größtenteils im Handel erhältlich sind es nicht. Versuche, translationale Fusionen Effektorproteine ​​und fluoreszierende Proteine ​​wie GFP verwenden, um die Translokation zu überwachen, waren nicht erfolgreich wahrscheinlich aufgrund der globularen Tertiärstruktur der fluoreszierenden Proteine ​​und der Unfähigkeit des Sekretionsapparates, sie vor Sekretion 13 entfalten. Doch verschiedene Reporter-Tags wie die cya (Calmodulin-abhängige Adenylatcyclase) Domäne des Bordetella pertussis Toxin cyclolysin 14 oder dem Flash-Tag wurden erfolgreich eingesetzt, um die Translokation zu analysieren. Im ersteren Assay die enzymatische Aktivität der cya wird verwendet, um das Signal des intrazellulären Fusionsprotein zu verstärken, während der Flash Tag, ein sehr kurzer Tetracysteinmotiv (4cys) Motiv-Tag ermöglicht die Kennzeichnung mit dem biarsenische Farbstoff Flash ohne den Prozess der Sekretion stören 15.

Das hier angewandte Konzept wurde erstmals von Charpentier et al. Berichtet, und ist an der intrazellulären Umwandlung des Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) Farbstoff CCF4 durch transloziert Effektor TEM-1-beta-Lactamase-Fusionen 16 (1A) auf der Basis. CCF4 / AM ist ein zelldurchdringenden Verbindung, in der ein Cumarin-Derivat (Donor) und eine Fluoresceingruppe (Akzeptor) werden durch ein Cephalosporin-Kerns verbunden ist. Beim passiven Eintritt in die eukaryotische Zelle, die nicht-fluoreszierende verestert CCF4 / AM-Verbindung durch zelluläre Esterasen zu der geladenen und fluoreszierende CCF4 verarbeitet und dadurch gefangeninnerhalb der Zelle. Anregung der Kumarin-Gruppe bei 405 nm ergibt FRET an die Fluoresceingruppe, die ein grünes Fluoreszenzsignal bei 530 nm emittiert. Nach der Spaltung des Cephalosporins Kern durch die Beta-Lactamase FRET gestört und Anregung der Kumarin-Gruppe führt zu blauen Fluoreszenzemission at460 nm. Verschiedene Anwendungen dieses Verfahrens sind in der Literatur Hervorhebung ihrer Vielseitigkeit beschrieben. Das Verfahren erlaubt die Analyse der Translokation in vitro als auch in vivo, beispielsweise wurde die Technik in einem Mausinfektionsmodell verwendet, um die Leukozyten-Populationen für die Translokation in vivo 17-19 gezielte identifizieren. Auslesen der Signale kann mit Plattenlesegeräte, FACS-Analyse oder Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt werden. Zu beachten ist, sieht das Verfahren auch die Möglichkeit, Translokation in Echtzeit Live-Zell-Mikroskopie während des Infektionsprozesses 20,21 überwachen. Hier wurde Laser-Scanning-Fluoreszenz-Mikroskopie für readou angewendett von Fluoreszenzsignalen da sie die höchste Empfindlichkeit und Genauigkeit. Insbesondere die Möglichkeit der Emissionsfenster mit Nanometer-Präzision in Kombination mit hochempfindlichen Detektoren erleichtert optimierte Fluoreszenzdetektion und minimiert ein Übersprechen zu justieren. Zusätzlich kann diese Einrichtung für die Mikroskopie eine Echtzeitüberwachung der Translokation angepasst werden und potenziell ermöglicht die gleichzeitige Analyse von Wirt-Pathogen-Interaktion auf zellulärer Ebene.

In dieser Studie Translokationsgeschwindigkeiten eines Y. enterocolitica Wildtyp-Stamm und eine YopE Deletionsmutante die eine hypertranslocator Phänotyp 10,11 wurden exemplarisch analysiert.

Protocol

1. Spitzenemission und Übersprechen Bestimmung (siehe auch Abbildung 2) Um die Emissionsspitzen und die Höhe des Übersprechens zwischen dem Donor (Cumarin-Derivat V450) und Akzeptor (Fluorescein) Farbstoffe zu bestimmen, führen spektralen Scans von Zellen, die sowohl einzelne Fluorophore bei 405 nm Anregung bezeichnet. Bestimmen einer 10 nm Bandbreite, innerhalb der Spitze von jedem Farbstoff, der für die Donor- und Akzeptor-Kanälen (hier: 455-465 nm und 525-535 nm) verwendet wird. Zeichnen Si…

Representative Results

Um die Leistungsfähigkeit des beschriebenen Verfahrens zeigen, um quantitativ zu analysieren Effektor Translokation in Zielzellen wurden zwei Yersinia-Stämmen mit unterschiedlichen Translokation Kinetik untersucht: Y. enterocolitica Wildtyp-Stamm WA-314 (Serogruppe O8, beherbergen die Virulenzplasmid pYVO8 22) und seine Ableitung WA-314ΔYopE (WA-314 beherbergt pYVO8ΔYopE 23). Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass Y. enterocolitica Mutanten ohne funktionelle YopE eine …

Discussion

Wir hier erfolgreich angewendet ein TEM-1-beta-Lactamase-Reporter-basierten Assay für die quantitative Analyse von Effektorzellen Translokation von Y. enterocolitica. Viele verschiedene Variationen dieses empfindliche, spezifische und relativ einfache Technik, wurden in der Literatur beschrieben worden. In dieser Studie wurde der Laser Scanning Mikroskopie für die empfindlichsten und präzise Detektion von Fluoreszenzsignalen durchgeführt. Insbesondere die Korrektur für das Übersprechen zwischen d…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Dr. Antonio Virgilio Failla for providing the FRET acquisition quantification algorithm and Erwin Bohn for providing the pMK-bla and pMK-ova constructs.

Materials

LB-Agar Roth X969.2
LB-Medium Roth X968.2
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D8662-500ML
96-well plate (black, clear bottom) Greiner Bio One 655087
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate Gibco/Life Technologies 31966-047
Probenecid Sigma-Aldrich P8761-25G
LiveBLAzer FRET-B/G Loading Kit with CCF4-AM Life Technologies K1095
Lectin from Triticum vulgaris (wheat) FITC conjugate Sigma-Aldrich L4895 Used for peak emission and cross-talk determination
V450 Rat anti-Mouse CD8a BD Bioscience 560469 Used for peak emission and cross-talk determination
Immersol W immersion oil  Zeiss 444969-0000-000 Refractive index = 1.3339 @ 23 °C
TCS SP5 II confocal laser scanning microscope Leica microsystems 2x GaAsP-Hybrid detectors, 4 channel spectrometer, acusto optical beam spliter, motorized XY stage, adjustable pinhole, objective 20x HC PL APO CS IMM/CORR, 405nm diode laser 50mW
Imaris 7.6 software Bitplane Plugins included ImarisXT and MeasurementPro
MatLab compiler runtime MathWorks
Prism 5 GraphPad software

Referenzen

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Wolters, M., Zobiak, B., Nauth, T., Aepfelbacher, M. Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions. J. Vis. Exp. (104), e53115, doi:10.3791/53115 (2015).

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