Terapia fotodinamica con Blended Condurre Polimero / Fullerene nanoparticelle fotosensibilizzanti
Summary
This protocol describes a method for the fabrication of conducting polymer nanoparticles blended with fullerene. These nanoparticles were investigated for their potential use as a next generation photosensitizers for Photodynamic Therapy (PDT).
Abstract
In this article a method for the fabrication and reproducible in-vitro evaluation of conducting polymer nanoparticles blended with fullerene as the next generation photosensitizers for Photodynamic Therapy (PDT) is reported. The nanoparticles are formed by hydrophobic interaction of the semiconducting polymer MEH-PPV (poly[2-methoxy-5-(2-ethylhexyloxy)-1,4-phenylenevinylene]) with the fullerene PCBM (phenyl-C61-butyric acid methyl ester) in the presence of a non-compatible solvent. MEH-PPV has a high extinction coefficient that leads to high rates of triplet formation, and efficient charge and energy transfer to the fullerene PCBM. The latter processes enhance the efficiency of the PDT system through fullerene assisted triplet and radical formation, and ultrafast deactivation of MEH-PPV excited stated. The results reported here show that this nanoparticle PDT sensitizing system is highly effective and shows unexpected specificity to cancer cell lines.
Introduction
In Terapia fotodinamica (PDT) fotosensibilizzanti vengono somministrati al tessuto bersaglio, e in seguito all'esposizione alla luce il fotosensibilizzante genera specie reattive dell'ossigeno (ROS). Specie ROS come l'ossigeno singoletto e superossido possono indurre lo stress ossidativo e la conseguente danno strutturale alle cellule e tessuti 1-4. Grazie alla sua facilità di applicazione questo metodo è stato attivamente indagato e gli studi clinici hanno avuto luogo 5,6. Tuttavia, le questioni rilevanti quali la tossicità scuro dei sensibilizzanti, la sensibilità del paziente alla luce (a causa della distribuzione non selettiva della sensibilizzante), e idrofobicità dei sensibilizzanti (che porta a ridurre la biodisponibilità e la potenziale tossicità acuta) rimangono.
Qui riportiamo un metodo per la fabbricazione e la valutazione in vitro di condurre nanoparticelle polimeriche miscelati con fullerene come fotosensibilizzatori prossima generazione per PDT. Le nanoparticelle sono formate da auto-aggregazione diil polimero semiconduttore MEH-PPV (poli [2-metossi-5- (2-etilesilossi) -1,4-phenylenevinylene]) con il PCBM fullerene (fenil-C 61 -butyric metil estere) quando questi materiali sciolti in un compatibile solvente stanno rapidamente iniettati in un solvente non compatibile (Figura 1A). La scelta di MEH-PPV come il polimero host è motivata dal suo elevato coefficiente di estinzione che porta ad alti tassi di formazione tripletta, e sia efficiente e ultraveloce carica e trasferimento di energia al PCBM fullerene 7. Queste proprietà sono ideali per la sensibilizzazione di ossigeno singoletto e formazione superossido in PDT.
Fullerene è stato infatti applicato nel PDT sia in forma molecolare e nanoparticelle 8-13. Tuttavia, una grave citotossicità ha ostacolato un ulteriore sviluppo 12. Qui mostriamo che incapsulando il fullerene in una matrice serie di MEH-PPV cedere compositi nanoparticelle MEH-PPV / PCBM risultati in un materiale sensibilizzare PDT che hoNon è citotossico intrinsecamente, mostra specificità verso le cellule tumorali a causa delle dimensioni delle nanoparticelle e carica di superficie, e le rese di trattamento altamente efficace PDT a dosi di luce scarsa a causa delle proprietà fotofisiche di cui sopra.
Protocol
Representative Results
Discussion
Per ottenere nanoparticelle assorbimento era necessario mantenere alcune misure critiche mentre fabbricare nanoparticelle. A 10 -6 M soluzione MEH-PPV (miscelato con il 50% in peso PCBM) in THF era disposto per iniettare in acqua DI, come è stato osservato che la concentrazione di questa soluzione ha un ruolo importante nel determinare le dimensioni di nanoparticelle in formazione. Concentrazione è stata verificata mediante spettroscopia UV-vis. Si noti che nel passaggio 2.1.3 protocollo era necessario dilu…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors gratefully acknowledge the National Science Foundation (NSF) for financial support of this work through a CAREER award (CBET-0746210) and through award CBET-1159500. We would like to thank Dr. Turkson (Univ. of Hawaii Cancer Center) and Dr. Altomare (Univ. of Central Florida College of Medicine) for assistance with cell culture.
Materials
| Poly[2-methoxy-5-(2-ethylhexyloxy)-1,4-phenylenevinylene] (MEH-PPV) | Sigma Aidrich | 536512-1G | average Mn 150,000-250,000 |
| [6,6]-Phenyl C61 butyric acid methyl ester (PCBM) | Sigma Aidrich | 684449-500MG | > 99.5% |
| Tetrahydrofuran (THF) | EMD | TX0284-6 | Drisolv |
| 1 ml syringe | National Scientific Company | 37510-1 | For filtration of MEH-PPV solution |
| Syringe filter | VWR | 28145-495 | 25 mm, 0.2 µm, PTFE |
| 1 ml syringe | Hamilton Company | 81320 | For injection of MEH-PPV solution into water to make nanoparticles |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium/Ham's F-12 50/50 Mix (DMEM) | Corning (VWR) | 45000-350 | |
| Hank's Balanced Salt Solution without phenol red (HBSS) | Quality Biological (VWR) | 10128-740 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1X without calcium and magnesium (DPBS) | Corning (VWR) | 45000-436 | |
| Fetal Bovine Serum, Regular (Heat Inactivated) (FBS) | Corning (VWR) | 45000-736 | |
| Trypsin EDTA 1X 0.25% | Corning (VWR) | 45000-664 | Trypsin/2.21 mM EDTA in HBSS without sodium bicarbonate, calcium and magnesium Porcine Parvovirus Tested |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% paraformaldehyde is diluted to 4% by adding PBS |
| DAPI | Biotium VWR | 89139-054 | Nuclear stain |
| 5 ml pipettes | VWR | 82050-478 | |
| 75 cm2 culture flask | VWR | 82050-856 | for culturing cells |
| 96-well plates | VWR | 82050-771 | for MTT assays |
| Tissue Culture Dishes with Vents | Greiner Bio-One (VWR) | 82050-538 | |
| Propidium iodide | Molecular probes | P3566 | |
| Annexin V FITC | Invitrogen | A13199 | dye for apoptosis |
| Celltiter 96 non-R 1000 assays | Promega (VWR) | PAG4000 | MTT |
| CellROX Green Reagent, for oxidative stress detection | Invitrogen | C10444 | For ROS detection |
| UV-vis spectrometer | Agilent 8453 | ||
| Fluorescence spectrometer | NanoLog HoribaJobin Yvon | ||
| Dynamic light scattering | PD2000DLS, Precision detector | ||
| Incubator | NuAir DH Autoflow | ||
| Confocal microscope | Zeiss Axioskop2 | 63X oil immersion objective lens | |
| Epiluminescence microscope | Olympus IX71 | 60X water immersion objective lens, Andor Zyla sCMOS camera | |
| Solar Simulator | Newport 67005 Oriel Instruments | ||
| Reference solar cell | Oriel | VLSI Standards Incorporated | |
| Microplate reader | BioTek Ex808 | ||
| Hemocytometer | Hausser Scientific Partnership | 3200 | For counting cells |
Referenzen
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