Summary

הקמת קלינית רלוונטי<em> Ex Vivo</em> דגם ניתוח קטרקט מוק לחקירת תיקון פצע אפיתל במייקרו-סביבה של ילידים

Published: June 05, 2015
doi:

Summary

Described here is the establishment of a clinically relevant ex vivo mock cataract surgery model that can be used to investigate mechanisms of the injury response of epithelial tissues within their native microenvironment.

Abstract

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to follow and manipulate the wound response ex vivo in an environment that closely mimics that of epithelial tissue injury in vivo. This issue was addressed by creating a clinically relevant epithelial ex vivo injury-repair model based on cataract surgery. In this culture model, the response of the lens epithelium to wounding can be followed live in the cells’ native microenvironment, and the molecular mediators of wound repair easily manipulated during the repair process. To prepare the cultures, lenses are removed from the eye and a small incision is made in the anterior of the lens from which the inner mass of lens fiber cells is removed. This procedure creates a circular wound on the posterior lens capsule, the thick basement membrane that surrounds the lens. This wound area where the fiber cells were attached is located just adjacent to a continuous monolayer of lens epithelial cells that remains linked to the lens capsule during the surgical procedure. The wounded epithelium, the cell type from which fiber cells are derived during development, responds to the injury of fiber cell removal by moving collectively across the wound area, led by a population of vimentin-rich repair cells whose mesenchymal progenitors are endogenous to the lens1. These properties are typical of a normal epithelial wound healing response. In this model, as in vivo, wound repair is dependent on signals supplied by the endogenous environment that is uniquely maintained in this ex vivo culture system, providing an ideal opportunity for discovery of the mechanisms that regulate repair of an epithelium following wounding.

Introduction

ניתוח הקטרקט הרלוונטי מבחינה קלינית, מדומה, לשעבר vivo מודל ריפוי פצעי אפיתל המתואר כאן פותח כדי לספק כלי לחקר המנגנונים המווסתים את התיקון של רקמות האפיתל בתגובה לפציעה. תכונות עיקריות שנועדו ביצירת מודל זה כלול 1 תנאים) ובלבד שמשוכפלים מקרוב את התגובה בvivo לנפצע בהגדרת תרבות, 2) להקל בויסות אלמנטי הרגולציה של תיקון, ו- 3) יכולת תמונת תהליך התיקון, בשלמותו, בזמן אמת. האתגר, לכן, היה ליצור מודל תרבות שבה ניתן היה ללמוד, ולטפל, לתקן פצע אפיתל במייקרו-הסביבה האם של התאים. הזמינות של מודל פצע-תיקון זה פותחת אפשרויות חדשות לזיהוי רמזי איתות אנדוגני ממטריצת חלבונים, ציטוקינים וכמוקינים המסדירים את תהליך התיקון. בנוסף, המודל אידיאלי לבחינה איךn האפיתל הוא מסוגל לנוע כגיליון קולקטיבי מחדש epithelialize אזור פצע 2,3, ולקביעת השושלת של תאי מנהיג mesenchymal בשולי הפצע שפועלים בהכוונת ההגירה הקולקטיבית של האפיתל נפצע 4. מודל זה גם מספק פלטפורמה שעם לזהות תרופות שיכולים לקדם את ריפוי פצע יעיל ולמנוע תיקון פצע חריג 5.

יש כבר מספר דגמי פצע-תיקון זמינים, הן בתרבות וin vivo, שספק את רוב מה שידוע על תהליך תיקון הפצע היום. במודלים של בעלי חיים פציעה, כגון קרנית 6-12 ועור 13-17, יש את ההזדמנות ללמוד את התגובה של הרקמה לפציעתם בהקשר של כל מתווכי התיקון שיכול להיות מעורב בתהליך, כוללים תרומות מ מערכת עצבים כלי דם ו. עם זאת, יש מגבלות למניפולציה של ההתנסותתנאים נפשיים in vivo, וזה עדיין לא ניתן לבצע מחקרי הדמיה של תגובת תיקון in vivo, רציף ולאורך זמן. לעומת זאת, רוב דגמי תרבות במבחנה פצע-תיקון, כגון פצע השריטה, ניתן להשפיע בקלות ואחריו לאורך זמן, אבל חסרים את ההקשר הסביבתי של לימוד ריפוי פצעים ברקמות in vivo. בעוד מודלים vivo לשעבר מציעים את היתרון של לימוד תהליך תיקון פגיעה ברציפות לאורך זמן בהקשר של מייקרו-הסביבה של התאים בשילוב עם היכולת לווסת את הרגולטורים המולקולריים של תיקון בכל נקודה בתהליך זמן, יש כמה דגמים שמתאימים אלה פרמטרים.

כאן מתואר הליך כדי ליצור vivo לשעבר פצע אפיתל מאוד לשחזור ריפוי תרבויות שלשכפל התגובה של רקמת האפיתל לפציעה פיזיולוגית. שימוש בעדשה עובר אפרוח כמקור רקמות, vivo לשעבר MOCניתוח קטרקט k מתבצע. העדשה היא רקמה אידיאלית לשימוש עבור מחקרים אלה שכן הוא בתוך כמוסת קרום במרתף עבה עצמאי, avascular, לא innervated, וללא כל סטרומה קשורה 18,19. במחלות של בני אדם, ניתוח קטרקט מתייחס לאובדן ראייה עקב עננות של העדשה, וכרוך בהסרת מסת תאי עדשת סיבים, הכוללת את חלק הארי של העדשה. חזון ניתוח קטרקט בעקבות משוחזר באמצעות ההחדרה של עדשה תוך-עינית מלאכותית. ניתוח הקטרקט, באמצעות הסרת תאי סיבים, גורם תגובת פציעה באפיתל העדשה הסמוכה, שמגיב בepithelialization מחדש של האזור האחורי של הקפסולה העדשה שנכבש על ידי תאי הסיבים. בניתוח קטרקט, כמו ברוב תגובות תיקון הפצע, יש לפעמים מתרחש תוצאה חריגה fibrotic לתגובת ריפוי הפצע, הקשורים בהופעתה של myofibroblasts, אשר בעדשה ידועה כאחורי Capsule העננות 20-22. על מנת ליצור את מודל ריפוי פצע ניתוח קטרקט, ניתוח קטרקט הוא חיקה בעדשות הוסרו מן העין עובר אפרוח לייצר פגיעה פיזיולוגית. הסרת מייקר תוצאות תאי עדשת סיבים באזור פצע עגול מאוד עקבי מוקף תאי אפיתל העדשה. אוכלוסיית תא זה נשארה מחובר היטב לכמוסת הקרום במרתף עדשה והוא נפגע על ידי ההליך כירורגי. תאי האפיתל להעביר על האזור הערום של הקרום במרתף אנדוגני לרפא את הפצע, בראשות אוכלוסייה של תאי mesenchymal vimentin העשיר הידועים בתהליך תיקון תאי מנהיג 1. בעזרת מודל זה התגובה של האפיתל לפציעה ניתן דמיין בקלות ואחריו עם זמן בהקשר של מייקרו-הסביבה של התאים. התאים נגישים לשינויים בביטוי או ההפעלה של המולקולות צפויות לשחק תפקיד בתיקון פצע. תכונה חזקה של ההוא מודל הוא היכולת לבודד ולחקור שינויי הגירה ספציפית במסגרת ריפוי פצעים. היכולת להכין מספר גדול של תרבויות בגילים תואמות vivo לשעבר ריפוי פצע ללימודים היא יתרון נוסף של מודל זה. לפיכך, מערכת מודל זה מספקת הזדמנות ייחודית ללהפריד מנגנוני תיקון פצע ותרופות מבחן להשפעתם על תהליך ריפוי פצע. מודל ניתוח קטרקט המדומה vivo לשעבר צפוי להיות תחולה רחבה, מתן משאבים קריטיים לחקר מנגנונים של תיקון פציעה.

Protocol

הפרוטוקול הבא עומד בהנחיות הטיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש אוניברסיטת תומס ג'פרסון ועם הצהרת ארוו לשימוש בבעלי חיים במחקר חזון. 1. התקנה והכנת עדשות לתרבות Ex Vivo פצע הנ?…

Representative Results

Ex Vivo דגם נוצר כדי ללמוד את תהליך ריפוי הפצע במייקרו-הסביבה האם של התאים לחקור מנגנונים מעורבים בויסות ריפוי פצע של האפיתל במייקרו-הסביבה המקומית של התאים, מודל ניתוח קטרקט רלוונטי קליני vivo לשעבר מדומה נוצר. מודל זה נוצר …

Discussion

Here is described a technique for preparing a culture model of wound repair that involves performing an ex vivo cataract surgery on chick embryo lenses after their removal from the eye. The lens epithelium responds to this clinically relevant wounding with a repair process that closely mimics that which occurs in vivo, and shares features with wound repair in other epithelial tissues2,4. While the protocol is straightforward and simple to follow, performing mock cataract surgery with embryoni…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by National Institutes of Health Grant to A.S.M. (EY021784).

Materials

Sodium Chloride (NaCl) Fisher Scientific S271-3 Use at 140mM in TD Buffer
Potassium Chloride (KCl) Fisher Scientific P217-500 Use at 5mM in TD Buffer
Sodium Phosphate (Na2HPO4) Sigma S0876 Use at .7mM in TD Buffer
D-glucose (Dextrose) Fisher Scientific D16-500 Use at 0.5mM in TD Buffer
Tris Base Fisher Scientific BP152-1 Use at 8.25mM in TD Buffer
Hydrochloric acid Fisher Scientific A144-500 Use to pH TD buffer to 7.4
Media 199 GIBCO 11150-059
L-glutamine Corning/CellGro 25-005-CI Use at 1% in Media199
Penicillin/streptomycin Corning/CellGro 30-002-CI Use at 1% in Media199
100mm petri dishes Fisher Scientific FB0875711Z
Stericup Filter Unit Millipore SCGPU01RE Use to filter sterilize Media
Dumont #5 forceps (need 2) Fine Science Tools 11251-20
35mm Cell Culture Dish Corning 430165
27 Gauge 1mL SlipTip with precision glide needle BD 309623
Fine Scissors Fine Science Tools 14058-11
Standard Forceps Fine Science Tools 91100-12
Other Items Needed: General dissection instruments,  fertile white leghorn chicken eggs, 
check egg incubator (humidified, 37.7°C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting 
microscope

Referenzen

  1. Walker, J. L., et al. Unique precursors for the mesenchymal cells involved in injury response and fibrosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 13730-13735 (2010).
  2. Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature reviews. Molecular cell biology. 10, 445-457 (2009).
  3. Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. Journal of laboratory automation. 17, 59-65 (2012).
  4. Khalil, A. A., Friedl, P. Determinants of leader cells in collective cell migration. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 2, 568-574 (2010).
  5. Walker, J. L., Wolff, I. M., Zhang, L., Menko, A. S. Activation of SRC kinases signals induction of posterior capsule opacification. Investigative ophthalmology & visual science. 48, 2214-2223 (2007).
  6. Sta Iglesia, D. D., Stepp, M. A. Disruption of the basement membrane after corneal debridement. Investigative ophthalmology & visual science. 41, 1045-1053 (2000).
  7. Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Brown, M., Stepp, M. A. A mouse model for the study of recurrent corneal epithelial erosions: alpha9beta1 integrin implicated in progression of the disease. Investigative ophthalmology & visual science. 45, 1775-1788 (2004).
  8. Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing. Experimental eye research. 93, 927-936 (2011).
  9. Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental eye research. 121, 178-193 (2014).
  10. Kuwabara, T., Perkins, D. G., Cogan, D. G. Sliding of the epithelium in experimental corneal wounds. Investigative ophthalmology. 15, 4-14 (1976).
  11. Sherrard, E. S. The corneal endothelium in vivo: its response to mild trauma. Experimental eye research. 22, 347-357 (1976).
  12. Stramer, B. M., Zieske, J. D., Jung, J. C., Austin, J. S., Fini, M. E. Molecular mechanisms controlling the fibrotic repair phenotype in cornea: implications for surgical outcomes. Investigative ophthalmology & visual science. 44, 4237-4246 (2003).
  13. Escamez, M. J., et al. An in vivo model of wound healing in genetically modified skin-humanized mice. The Journal of investigative dermatology. 123, 1182-1191 (2004).
  14. Werner, S., Breeden, M., Hubner, G., Greenhalgh, D. G., Longaker, M. T. Induction of keratinocyte growth factor expression is reduced and delayed during wound healing in the genetically diabetic mouse. The Journal of investigative dermatology. 103, 469-473 (1994).
  15. Tarin, D., Croft, C. B. Ultrastructural studies of wound healing in mouse skin. II. Dermo-epidermal interrelationships. Journal of anatomy. 106, 79-91 (1970).
  16. Croft, C. B., Tarin, D. Ultrastructural studies of wound healing in mouse skin I. Epithelial behaviour. Journal of anatomy. 106, 63-77 (1970).
  17. Winstanley, E. W. The epithelial reaction in the healing of excised cutaneous wounds in the dog. Journal of comparative pathology. 85, 61-75 (1975).
  18. Wormstone, I. M., Wride, M. A. The ocular lens: a classic model for development, physiology and disease. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 366, 1190-1192 (2011).
  19. Danysh, B. P., Duncan, M. K. The lens capsule. Experimental eye research. 88, 151-164 (2009).
  20. Awasthi, N., Guo, S., Wagner, B. J. Posterior capsular opacification: a problem reduced but not yet eradicated. Archives of ophthalmology. 127, 555-562 (2009).
  21. Walker, T. D. Pharmacological attempts to reduce posterior capsule opacification after cataract surgery–a review. Clinical & experimental ophthalmology. 36, 883-890 (2008).
  22. Schmidbauer, J. M., et al. Posterior capsule opacification. International ophthalmology clinics. 41, 109-131 (2001).
  23. Menko, A. S., et al. A central role for vimentin in regulating repair function during healing of the lens epithelium. Molecular biology of the cell. 25, 776-790 (2014).
  24. Chauss, D., et al. Differentiation state-specific mitochondrial dynamic regulatory networks are revealed by global transcriptional analysis of the developing chicken lens. G3 (Bethesda). 4, 1515-1527 (2014).
  25. Leonard, M., Zhang, L., Bleaken, B. M., Menko, A. S. Distinct roles for N-Cadherin linked c-Src and fyn kinases in lens development. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 242, 469-484 (2013).
  26. Sieg, D. J., et al. FAK integrates growth-factor and integrin signals to promote cell migration. Nature cell biology. 2, 249-256 (2000).
  27. Sieg, D. J., Hauck, C. R., Schlaepfer, D. D. Required role of focal adhesion kinase (FAK) for integrin-stimulated cell migration. Journal of cell science. 112 (Pt 16), 2677-2691 (1999).
  28. Hauck, C. R., Hsia, D. A., Schlaepfer, D. D. The focal adhesion kinase–a regulator of cell migration and invasion). IUBMB life. 53, 115-119 (2002).
  29. Zhao, X., Guan, J. L. Focal adhesion kinase and its signaling pathways in cell migration and angiogenesis. Advanced drug delivery reviews. 63, 610-615 (2011).
  30. Menko, A. S., Bleaken, B. M., Walker, J. L. Regional-specific alterations in cell-cell junctions, cytoskeletal networks and myosin-mediated mechanical cues coordinate collectivity of movement of epithelial cells in response to injury. Experimental cell research. 322, 133-148 (2014).
  31. Martin, P. Wound healing–aiming for perfect skin regeneration. Science. 276, 75-81 (1997).
  32. Ferguson, M. W., O’Kane, S. Scar-free healing: from embryonic mechanisms to adult therapeutic intervention. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 359, 839-850 (2004).
  33. Redd, M. J., Cooper, L., Wood, W., Stramer, B., Martin, P. Wound healing and inflammation: embryos reveal the way to perfect repair. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 359, 777-784 (2004).
  34. Nodder, S., Martin, P. Wound healing in embryos: a review. Anatomy and embryology. 195, 215-228 (1997).
  35. Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453, 314-321 (2008).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Walker, J. L., Bleaken, B. M., Wolff, I. M., Menko, A. S. Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment. J. Vis. Exp. (100), e52886, doi:10.3791/52886 (2015).

View Video