עירוי stereotaxic של Oligomeric עמילואיד-ביתא להיפוקמפוס העכבר
Summary
Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.
Abstract
מחלת אלצהיימר היא מחלה ניוונית של מערכת עצבים המשפיעה על הזדקנות האוכלוסייה. תכונת נוירו מפתח של המחלה היא ייצור היתר של עמילואיד-ביתא והתצהיר של לוחות עמילואיד-ביתא באזורים במוח של האנשים הנגועים. לאורך שנות מדענים יצרו מודלים עכבר מחלת אלצהיימר רבים המנסים לשכפל את הפתולוגיה עמילואיד-ביתא. למרבה הצער, המודלים העכבר רק באופן סלקטיבי לחקות את תכונות המחלה. מוות עצבי, השפעה בולטת במוחם של החולים במחלת האלצהיימר, חסר ניכר בעכברים אלו. לפיכך, אנו ואחרים מועסקים שיטה של יציקת ישירות מינים מסיסים oligomeric של עמילואיד-ביתא – צורות של עמילואיד-ביתא שהוכחו כרעילים ביותר לתאי עצב – stereotaxically לתוך המוח. בדוח זה אנו מנצלים זכר C57BL / 6J לתעד טכניקה ניתוחית זו של הגדלת רמות עמילואיד-ביתא באזור במוח בחר.יעד עירוי הוא gyrus המשונן של ההיפוקמפוס בגלל מבנה המוח הזה, יחד עם המוח הקדמי הבסיסי שמחובר על ידי מעגל כולינרגית, מייצג את אחד מהאזורים של ניוון במחלה. התוצאות של הרמת עמילואיד-ביתא ברכס המשונן באמצעות עירוי stereotaxic לחשוף עלייה באובדן תא עצב ברכס המשונן בתוך השבוע 1, בעוד שיש עלייה במקביל במוות של תאים ואובדן תא עצב כולינרגית באיבר האנכי של הלהקה האלכסונית של ברוקה של המוח הקדמי הבסיסי. תופעות אלה נצפו עד 2 שבועות. הנתונים שלנו מצביעים על כך שמודל עירוי עמילואיד-ביתא הנוכחי מספק מודל עכבר חלופי לטיפול במות נוירון ספציפי אזור בבסיס לטווח קצר. היתרון של מודל זה הוא שעמילואיד-ביתא יכול להיות מורם באופן מרחב ובזמן.
Introduction
פיקדונות עמילואיד פלאק, אשר מורכבים של עמילואיד-ביתא (Aβ 1-42), הם תכונה מרכזית של הפתולוגיה של מחלת אלצהיימר (AD). מחקרים רבים הראו כי רמות גבוהות או רעילות של Aβ oligomeric רקומביננטי 1-42 לעורר מוות עצבי, ניוון הסינפטי, אובדן וחוסר תפקוד; וכן את גירעונות למידה וזיכרון 1-4. אזורים במוח המושפעים כוללים את ההיפוקמפוס, קליפת המוח, ומבנים קורטיקליים כגון המוח הקדמי הבסיסי ו5,6 האמיגדלה. נכון להיום, יש מודלים עכבר מהונדסים מרובים המנסים לדמות את הפתולוגיה Aβ 1-42 של הספירה. בהתאם לזן בעלי חיים אלה להוכיח להיות שימושיים בבדיקה פתולוגית תכונות נבחרות של הספירה. למרבה הצער, למעט 2 קווים מהונדסים, APP23 ו5XFAD, עכברים אלה לא לשכפל באופן מלא איבוד עצבי, היבט מרכזי של הספירה. אפילו עם האובדן העצבי שנצפה בAPP23 ו5XFAD, obser המוות העצביved היה עדין, גיל תלוי, ומבודד לאזורים נבחרים כמה 7,8.
העירוי הישיר של Aβ oligomeric 1-42 לתוך מוח עכבר wild-type מספק מצוין במודל vivo שמשכפל את היבט המוות העצבי של amyloidopathy 1,9,10. בניגוד למודלי העכבר המהונדס הנפוצה ניצלו את מודל עירוי oligomeric Aβ 1-42 הוא אידיאלי עבור חריפות הרמת Aβ 1-42 רמות באופן מרחב ובזמן. היתרון של שימוש בעכברי wild-type עבור דגם זה מבטל השפעות פיצוי או צד פוטנציאל מהמוטציות הציגו בקווי עכבר מהונדסים. מחקרים קודמים הראו כי רמות רעילות של יציקת Aβ 1-42 להיפוקמפוס מעוררת מות נוירון בקרבת אתר ההזרקה בתוך השבוע 1 1. יתר על כן, עולה בקנה אחד עם התצפית שAβ 1-42 הוא רעיל לתאי עצב כולינרגית 11 המוח הקדמי הבסיסיאוכלוסיית כולינרגית נוירון (BFCN) שמקרינה להיפוקמפוס היא ירד 20-50% בתוך 7-14 ימים הבאים עירוי בטא-עמילואיד בעכברי 1,10, ביעילות ומאפשרת לבחינות של מעגלים עצביים במוח מבודד. מאז פרויקט BFCN ipsilaterally לgyrus המשונן של 12 היפוקמפוס, לשליטה חלק / הרכב וAβ 1-42 פתרונות oligomeric ביותר ניתן להזריק בכל צד של המוח ומאפשר השוואות שנעשו בין האונות ימנית והשמאלי 1.
בדוח זה אנו מספקים מתודולוגיה ניתוח והזרקה מפורטת לC57BL / 6J עכברים בוגרים wild-type. זן עכבר זה נבחר בשל השימוש הרחב שלה במחקר. מבחינה טכנית, כל אזור במוח יכול להיות ממוקד לעירוי, אולם כאן אנו משתמשים ברכס המשונן של ההיפוקמפוס כמטרה להמחיש את הטכניקה.
Protocol
Representative Results
Discussion
כדי להשיג הזרקת Aβ 1-42 מוצלחת הנסיין או המנתח חייב: 1) להשתמש בטכניקה האספטי; 2) בצורה נכונה לזהות את האזור במוח של עניין עם קואורדינטות מדויקות; 3) להיות מסוגל לאבטח את העכבר כראוי במסגרת stereotaxic עם המוח המפולס בציר AP וML; 4) יש את היכולת להפעיל את micromanipulator עם דיוק; 5) להב…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ להעניק NS081333 (לCMT), NIRG-10-171,721 אלצהיימר מענק האיגוד והמכון הלאומי לבריאות נפש מענק MH096702 (לUH), ומכון לאומי להזדקנות במימון מחקר מחלת אלצהיימר מרכז בAG008702 מענק טייס אוניברסיטת קולומביה (לYYJ וJB).
Materials
| Ketamine HCl (100mg/ml) | Henry Schein Medical | 1049007 | 100 mg ketamine per 1 kg animal |
| Xylazine (20mg/ml) | Henry Schein Medical | not available | 10 mg xylazine per 1 kg animal |
| Buprenex (0.3mg/ml) | Henry Schein Medical | 1217793 | 0.1 mg buprenex per 1 kg animal |
| Aβ1-42 | David Teplow/UCLA | not available | 100 μM; This amyloid was used in the paper |
| Aβ1-42 | Bachem | H-1368 | Can be used in place of amyloid from the Teplow lab |
| Aβ1-42 | American Peptide | 62-0-80B | Can be used in place of amyloid from the Teplow lab |
| Scrambled Aβ1-42 | American Peptide | 62-0-46B | Can be used as control peptide for comparing Aβ1-42 |
| NU4 Antibody (Oligomeric Amyloid Antibody) | Gift from William Klein/Northwestern U. | not available | 1:2000 dilution |
| Anti-Amyloid Oligomeric Antibody (Polyclonal Rabbit) | EMD Millipore | AB9234 | May be used in place of Nu4; needs to be tested by the end user |
| 6E10 Antibody (Monoclonal Mouse) (Amyloid Antibody) | Biolegend | sig-39320 | 1:1000 dilution |
| ChAT Antibody (Polyclonal Goat) | Millipore | AB144P | 1:100 dilution |
| DeadEnd Fluorometric TUNEL system | Promega | G3250 | Follow manufacturer's directions for use |
| Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Use when coverslipping slides |
| Fluorogold | Fluorochrome, LLC | not available | 2% solution |
| Absolute Ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-4 | For making 70% ethanol for sanitizing and disinfecting |
| Novex 10-20% Tricine gel | Life Technologies | EC6625BOX | For separating Aβ1-42 |
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10X) | Life Technologies | LC1675 | For running 10-20% Tricine gels |
| Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X) | Life Technologies | LC3675 | For transferring 10-20% Tricine gels |
| SuperSignal Western Blot Enhancer | Thermo Scientific | 46640 | For enhancing Aβ1-42 signal; follow manufacturer's protocol |
| Protran BA79 Nitrocellulose Blotting Membrane, 0.1 μm | GE Healthcare Life Sciences | 10402088 | For transferring 10-20% Tricine gels |
| Xcell SureLock Mini-Cell | Life Technologies | EI0001 | Electrophoresis aparatus for running 10-20% Tricine gels |
| GenTeal Lubricant Eye Gel | Novartis | not available | For keeping the mouse eyes moist during surgery; can be found in local pharmacy stores |
| Refresh Optive Lubricant Eye Drops | Allergan | not available | For keeping the mouse eyes moist during surgery; can be found in local pharmacy stores; Can be used in place of GenTeal |
| Betadine | Stoelting | 50998 | For sanitizing and disinfecting |
| Round/Tapered Spatula | VWR | 82027-490 | For opening animal mouth |
| Bulldog Serrefines Clamps (Jaw Dims. 9X1.6mm; Length 28mm) | Fine Science Tools | 18050-28 | Optional; For keeping scalp skin apart during injection |
| Straight Fine Scissors (Cutting edge 25mm; Length 11.5cm) | Fine Science Tools | 14060-11 | For cutting scalp |
| #3 Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| #11 Surgical Blade | Fine Science Tools | 10011-00 | For making scalp incision |
| Student Standard Pattern Forcep (Tip Dims. 2.5×1.5mm; Length 11.5cm) | Fine Science Tools | 91100-12 | For holding scalp closed during suturing |
| Trimmer Combo Kit | Kent Scientific | CL9990-1201 | For shaving hair |
| T/Pump Warm Water Recirculator | Kent Scientific | TP-700 | For warming animal during surgery |
| Resusable Warmining Pad (5" x 10") | Kent Scientific | TPZ-0510FEA | For attaching it to the T/Pump warm water recirculator to warm the animal during surgery |
| Cordless Micro Drill | Stoelting | 58610 | Use 0.8mm steel burrs to drill holes in the skull |
| Lab Standard Stereotaxic Instrument with Mouse & Neonatal Rat Adaptor | Stoelting | 51615 | |
| Just for Mouse Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51730 | Can use this in place of Stoelting Cat. #51615 |
| Quintessential Stereotaxic Injector | Stoelting | 53311 | |
| Dry Glass Bead Sterilizer | Stoelting | 50287 | For sterilizing stainless steel instruments |
| Sterile Surgical Drape (18" x 26") | Stoelting | 50981 | |
| Hamilton Syringe 50 ml, Model 705 RN SYR, NDL | Hamilton Company | 7637-01 | For brain injection; use different syringes for different solutions |
| 29 Gauge Needle, Small Hub RN NDL | Hamilton Company | 7803-06 | For attaching to the Hamilton syringe for brain injection |
| 1 ml BD Tuberculin Syringes | VWR | BD309659 | For administering anesthesia and saline |
| 30 Gauge Needle (0.5") | VWR | BD305106 | For administering anesthesia and saline |
| Portable Electronic CS Series Scale (Ohaus) | VWR | 65500-202 | For weighing animals to determine anesthesia dose |
| Hot plate (Top Plate Dims. 7.25×7.25in) | VWR | 47751-148 | For warming animals post-surgery |
| Sofsilk Silk Suture C-1 Cutting 3/8, 12 mm | Covidien | S1173 | For closing wound |
| Vetbond Tissue Adhesive (3M) | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | Optional: for aiding in wound closure; Use with suture. |
| Cotton-Tipped Wooden-Shaft Sterile Applicators | Fisher scientific | 22-029-488 | For cleaning and drying surgical wound |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | For collecting brain sections |
| VWR Micro Cover Glass 24 X 50 mm | VWR | 48393241 | For mounting microscope slides |
| Thermo Scientific Nalgene Syringe Filter 0.2 μm | Fisher Scientific | 194-2520 | For sterilizing saline solution |
| Sterile dual tip skin markers by Viscot Medical | Medline | VIS1422SRL91 | For marking coordinates on the skull |
Referenzen
- Baleriola, J., et al. Axonally Synthesized ATF4 Transmits a Neurodegenerative Signal across Brain Regions. Cell. 158 (5), 1159-1172 (2014).
- Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer’s amyloid beta-peptide. Nature reviews. Molecular cell biology. 8 (2), 101-112 (2007).
- Knowles, J. K., et al. The p75 neurotrophin receptor promotes amyloid-beta(1-42)-induced neuritic dystrophy in vitro and in vivo. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (34), 10627-10637 (2009).
- Troy, C. M., et al. beta-Amyloid-induced neuronal apoptosis requires c-Jun N-terminal kinase activation. Journal of neurochemistry. 77 (1), 157-164 (2001).
- Crews, L., Rockenstein, E., Masliah, E. APP transgenic modeling of Alzheimer’s disease: mechanisms of neurodegeneration and aberrant neurogenesis. Brain structure & function. 214 (2-3), 111-126 (2010).
- Gotz, J., Ittner, L. M. Animal models of Alzheimer’s disease and frontotemporal dementia. Nature reviews. Neuroscience. 9 (7), 532-544 (2008).
- Calhoun, M. E., et al. Neuron loss in APP transgenic mice. Nature. 395 (6704), 755-756 (1998).
- Oakley, H., et al. Intraneuronal beta-amyloid aggregates, neurodegeneration, and neuron loss in transgenic mice with five familial Alzheimer’s disease mutations: potential factors in amyloid plaque formation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26 (40), 10129-10140 (2006).
- Jean, Y. Y., et al. Caspase-2 is essential for c-Jun transcriptional activation and Bim induction in neuron death. The Biochemical journal. 455 (1), 15-25 (2013).
- Sotthibundhu, A., et al. Beta-amyloid(1-42) induces neuronal death through the p75 neurotrophin receptor. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28 (15), 3941-3946 (2008).
- Kar, S., Quirion, R. Amyloid beta peptides and central cholinergic neurons: functional interrelationship and relevance to Alzheimer’s disease pathology. Progress in brain research. 145, 261-274 (2004).
- Leranth, C., Frotscher, M. Organization of the septal region in the rat brain: cholinergic-GABAergic interconnections and the termination of hippocampo-septal fibers. The Journal of comparative neurology. 289 (2), 304-314 (1989).
- Fa, M., et al. Preparation of oligomeric beta-amyloid 1-42 and induction of synaptic plasticity impairment on hippocampal slices. Journal of visualized experiments : JoVE. (41), (2010).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2001).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of visualized experiments : JoVE. (65), (2012).
- Currle, D. S., Monuki, E. S. Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain. Journal of visualized experiments : JoVE. (4), (2007).
- Jin, M., et al. Soluble amyloid beta-protein dimers isolated from Alzheimer cortex directly induce Tau hyperphosphorylation and neuritic degeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (14), 5819-5824 (2011).
- Lambert, M. P., et al. Diffusible, nonfibrillar ligands derived from Abeta1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (11), 6448-6453 (1998).
- Masters, C. L., Selkoe, D. J. Biochemistry of amyloid beta-protein and amyloid deposits in Alzheimer disease. Cold Spring Harbor perspectives in medicine. 2 (6), a006262 (2012).
- Chakrabarti, M., et al. Estrogen receptor agonists for attenuation of neuroinflammation and neurodegeneration. Brain research bulletin. 109C, 22-31 (2014).
- Cirrito, J. R., et al. In vivo assessment of brain interstitial fluid with microdialysis reveals plaque-associated changes in amyloid-beta metabolism and half-life. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23 (26), 8844-8853 (2003).
- Puzzo, D., et al. Picomolar amyloid-beta positively modulates synaptic plasticity and memory in hippocampus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28 (53), 14537-14545 (2008).
- Puzzo, D., et al. Endogenous amyloid-beta is necessary for hippocampal synaptic plasticity and memory. Annals of. 69 (5), 819-830 (2011).
- Akpan, N., et al. Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).
- Fulmer, C. G., et al. Astrocyte-derived BDNF supports myelin protein synthesis after cuprizone-induced demyelination. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34 (24), 8186-8196 (2014).
- Thakker-Varia, S., et al. The neuropeptide VGF is reduced in human bipolar postmortem brain and contributes to some of the behavioral and molecular effects of lithium. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (28), 9368-9380 (2010).
- Greferath, U., et al. Enlarged cholinergic forebrain neurons and improved spatial learning in p75 knockout mice. The European journal of neuroscience. 12 (3), 885-893 (2000).
- Brashear, H. R., Zaborszky, L., Heimer, L. Distribution of GABAergic and cholinergic neurons in the rat diagonal band. Neurowissenschaften. 17 (2), 439-451 (1986).
- Clarke, D. J. Cholinergic innervation of the rat dentate gyrus: an immunocytochemical and electron microscopical study. Brain research. 360 (1-2), 349-354 (1985).
- Garcia-Osta, A., Alberini, C. M. Amyloid beta mediates memory formation. Learning & memory. 16 (4), 267-272 (2009).
