We describe a protocol for hybrid imaging, combining fluorescence-mediated tomography (FMT) with micro computed tomography (µCT). After fusion and reconstruction, we perform interactive organ segmentation to extract quantitative measurements of the fluorescence distribution.
형광 매개 단층 촬영 (FMT)는 생체 내에서 형광 분포의 종 방향 및 정량이 가능하고 신규 한 프로브의 생체 분포를 평가하고 수립 분자 프로브 또는 리포터 유전자를 이용하여 질병의 진행을 평가하기 위해 사용될 수있다. 예를 들면 해부학 적 양상과 조합은, 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (μCT), 이미지 분석 및 형광 재건 유리하다. 우리는 정량적 측정을 추출하는 데 필요한 화상 처리 단계를 포함한 멀티 모달 μCT-FMT 이미징을위한 프로토콜을 기술한다. 마우스를 준비하고, 촬상을 수행 한 후, 복합 데이터 세트가 등록된다. 이어서, 개선 된 형광 재구성 고려 마우스의 형상을 취하는, 수행된다. 정량 분석을 위해, 기관 세그먼테이션은 대화 형 분할 도구를 사용하여 해부학 적 데이터에 기초하여 생성된다. 마지막으로, 생체 분포 CUrves 일괄 처리 기능을 사용하여 생성됩니다. 우리는 뼈와 관절 결합 공지 프로브의 생체 분포를 평가함으로써 상기 방법의 적용을 나타낸다.
형광 매개 단층 촬영라고도 형광 분자 단층 (FMT)는 정량적 같은 마취 된 쥐 또는 인간의 신체 조직, 예를 들면, 유방이나 손가락 관절 등 미만성 조직에서 형광 분포를 평가하기위한 유망한 기술이다. 세포 내 해상도 1 표면의 촬상 대상을 허용 비 침습적 현미경 기술에 대조적으로, FMT는 저해상도이 낮아지기 수 ㎝, 깊이 형광 소스 삼차원 재구성을 허용한다. 5 – 많은 대상으로 형광 프로브는 이미지 혈관 신생, 세포 사멸, 염증 등 2 사용할 수 있습니다. 일부 프로브는, 기동 있습니다 예를 들어., 형광 색소의 unquenching로 이어지는 특정 효소 절단에 의해. 또한, 형광 단백질을 발현하는 리포터 유전자는 종양 세포의 이동을 추적하기 위해 6, 예를 들면, 묘화 될 수있다.
FMT는 강하게 예를 들어, 2,7 또는 자기 공명 영상 (8) μCT, 해부학 적 양상과 조합의 혜택. 독립형 FMT 장치 상업적 9 사용할 수 있지만, 형광 이미지는 해부학 적 기준 정보없이 해석하기가 어렵다. 최근 우리는 융합 해부학 화상 데이터보다 강력한 분석을 가능하게한다는 10, 표시 할 수 있었다. 해부학 적 데이터는 또한 정확한 광학 모델링 및 형광 재 (11)에 대한 중요한 마우스의 외형으로 사전 지식을 제공하기 위해 사용될 수있다. 또한, 광 산란 및 흡수 맵 조직 유형의 분할을 사용하여 추정 된 계수 12,13 특정 클래스를 할당하여 할 수있다. 근적외선 들어 헤모글로빈 멜라닌 모피 14 게다가 마우스에서 주요 흡수이다. 상대 혈액량은 크기 순서에 의해 지역적으로 변화하기 때문에, 흡수지도 콴 특히 중요titative 형광 재 (13).
비 침습적 촬상 장치를 사용하는 하나의 장점은 생쥐 여러 시점에서, 즉, 종 방향으로 묘화 될 수 있다는 것이다. 이는 프로브의 동적 거동, 즉, 타겟 축적, 배설물 및 생체 분포를 평가하기 위해 10, 15, 또는 질병의 진행 (16)을 평가하는 것이 중요하다. 여러 시점에서 여러 생쥐 촬상하면, 이미지 데이터 집합의 다량 발생한다. 비교를 활성화하려면 다음은 잘 정의되고 문서화 된 프로토콜로, 체계적으로, IE에서 취득해야한다. 스캔의 다수의 이미지 데이터로부터 양적 측정 값을 추출하는 데 필요한 화상 분석을위한 도전을 제기.
본 연구의 목적은 여러 연구에 걸쳐 10,13,15,17,18 우리가 사용하는 최적화 μCT-FMT 촬상 프로토콜의 상세한 설명을 제공하는 것이다. 우리는 기술데이터 세트가 생성되는 방법, 시각 처리하고 분석 하였다. 이것은 19 수산화 인회석에 결합 설립 분자 프로브, OsteoSense를 사용 입증되고, 화상 골 질환에 사용될 수 있으며,이 개조. 동물과 관련된 모든 절차는 동물 보호에 대한 정부 심의위원회에 의해 승인되었다.
우리는 기술과 복합 μCT-FMT 이미징을위한 프로토콜을 적용 할 수 있습니다. 17,21 – 우리는 상업적으로 이용 가능하고 널리 사용되는 FMT 및 μCT 장치 3,11,15를 사용합니다. 프로토콜이 특정 FMT를 요구하지만,이 μCT 예와 유사한 기능과 유사한 주사 파라미터와 다른 μCT 의해 대체 될 수 있고, 시야각은 마커를 포함 마우스 침대 커버 할만큼 커야한다.
FMT는 μCT 또는 MRI (21)과 결합하지 않고 생체 분포 분석에 사용 된, 그러나, 해부학 적 데이터 세그먼트가 μCT 데이터 (10)에서 볼 수있는 장기 경계에 기초 할 수 있기 때문에, 재현성을 높이기 위해 유리하다. 집적 μCT-FMT 장치 2,7- 개발되었지만, 이것들은 아직 시판되지 않는다. 또한, 두 개의 분리 된 장치의 사용은 배관, 즉 허용한다. 그 다음, 마우스를 CA먼저 마우스가 처리량을 증가시키기 위해, FMT에있는 동안 N μCT에 이미징 될 수있다.
수동 작업 부하를 줄이기 위해, 우리는 자동화 된 마커 검출 및 융합을 수행합니다. 또한, 마우스의 형상은 자동 분할되고,이 정보는 크게 형광 재구성 11,13,22을 향상시킨다. 양적 형광 재건, 흡수 및 산란지도는 13, 23를 필요합니다. 우리는 μCT 데이터의 자동 분할 및 여러 가지 조직 유형의 알려진 산란 계수 할당 (폐, 뼈, 피부, 지방, 그리고 남아있는 부드러운 조직) (24)에 의해 산란지도를 유도. 다음으로, 우리는 심장 및 간 13, 20는 물론 관류 기관 특히 중요 광학 원시 데이터로부터 흡수 맵을 재구성.
여러 시점에서 여러 마우스 스캔하면 신속하게 데이터의 다수를 초래하여 분석 할 설정한다. biodis 들어기여도 연구는 여러 기관은 각각 μCT-FMT 스캔을 위해 분할 할 필요가있다. 마우스 새롭게 반복적 마우스 침대에 배치되어 있기 때문에 불행히도, 세그먼테이션이 재사용 될 수 없다. 우리는 우리 연구소에서 개발 한 대화 형 분할을위한 도구를 사용하지만, 다른 도구는 25 적절할 수 있습니다. 이 같은 타원과 큐브 (26)와 같은 간단한 모양보다 복잡한 기관에 더 적합하기 때문에 우리는 복셀 현명한 세분화를 생성합니다. 자동화 된 전체 동물 세그멘테이션 더 수동 부하 (27)를 감소하는 것이 유용 할 것이지만, 대화식 분할 도구 여전히 세그멘테이션 오류를 수정하기 위해 요구된다. 또한, 자동 분할 도구는 제대로 병리 등의 특별한 경우를 거의 예상 할 수 없습니다. 우리는 원시 μCT 스캔을 사용하기 때문에, 예컨대 비장 등의 기관 일부는 심지어 수동 세그먼트 매우 어렵다. 조영제는 도움이 될,하지만 내약성에 문제가있다 그것은 maintai 어렵다길이 영상을 통해 NA 정상 조영제의 분포.
우리 팬텀 연구 형광 재건 형상 정보를 사용할 때, 신호 위치 파악이 개선되어있는 것을 알 수있다. 생체가 유사한 개선 이른 시점에 대한 프로브의 다량 이미 (주입 후 15 분), 명백한 방광. 하이드 록시 아파타이트 결합 프로브는 뼈와 관절에 축적한다. 이것이 즉, 신호가 이미 주입 후 척추 15 분에서 명확하게 볼 수 있습니다 발생 얼마나 빨리 현저하다. 이것은 아마 대상 지역 패스트 넘쳐 확산을 가능 프로브의 낮은 분자량에 기인한다. 프로브는 대상 하이드 록시 아파타이트에 공유 결합과 결합되지 않은 프로브는 배설된다. 이후 시점의 경우, 6 시간 및 주입 후 24 시간 사이의 척추에서의 신호 강도는, 아마도 상대적으로 안정적으로 유지 거의 광 재 때문에형광 표백제 깊은 마우스로 아파. 우리의 연구를 위해, 우리는 주입 전에 취득한 스캔으로 분명 낮은 배경 형광 결과 750 nm의 채널을 사용했다. 보다 낮은 파장들에서, 더 많은 배경 신호 (28)를 기대할 수있다.
요약하면, 우리는 시중에서 판매하는 FMT 및 μCT 장치를위한 멀티 모달 이미징 프로토콜을 설명합니다. 우리는 조합이 형광 재건을위한 혜택을 제공 것으로 나타났다. 우리는 생체 분포 곡선 대화식 장기 분할 및 일괄 처리를 이용하여 화상 데이터의 대량 추출되는 방법을 예시한다. 우리는이 표준화 된 워크 플로우는 신약 개발과 형광 표지 된 프로브를 사용하여 다른 영상 연구에 도움이 될 수 있다고 생각합니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 팬텀 실험을 수행하기위한 마렉 WEILER 감사합니다. 이 작품은 유럽 연구위원회 (ERC 시작 부여 309495 : NeoNaNo)에 의해 지원되었다, 노르 트라 인 베스트 팔렌의 독일 연방 주 (노르 트라 인 베스트 팔렌, High-Tech.NRW/EU-Ziel 2 programm에 (EFRE) ForSaTum), 독일 교육 및 연구 (BMBF)에 대한 정부 (재정 지원 프로그램 가상 간 (0315743), LungSys (0315415C), LungSys2 (0316042F), Photonik Forschung 독일 (13N13355)), RWTH 아헨 대학 (나는 3 TM 종자 기금), 필립스 연구 (아헨, 독일).
FMT (Fluorescence molecular tomography) FMT2500 LX | PerkinElmer | FMT2000 | Device for fluorescence molecular tomography |
µCT (micro computed tomography) Tomoscope Duo | CT Imaging GmbH | Tomoscope Duo | Device for micro computed tomography |
Multimodal Mouse Bed | CT Imaging GmbH | Experimental builder | Partially transparent animal holder |
IsoFlo (isoflurane, USP) | Abbott | 05260-05 | Isoflurane Inhalation anesthesia |
Small animal anesthesia system | Harvard apparatus | 726419 | Complete Isoflurane Table-Top System |
Chlorophyll-free mouse food | Ssniff | E15051 | low chlorophyll / low fluorescence food |
OsteoSense 750EX | PerkinElmer | NEV10053EX | Animal FMT contrast agent |
Portex Fine Bore Polythene Tubing | Smith medical | 800/100/120 | Tube for injection catheter |
Sterican 30g | BBraun | 4656300 | Hypodermic needle for catheter |
Imeron | Altana pharma | INLA F.1/0203/3.5337.69 | CT contrast agent for the phantom inclusions |
Agarose | Sigma | 90-12-36-6 | Agarose for phantom production |
TiO2 | Applichem | A1900,1000 | Titanium oxyde as phantom scattering agent |
Trypan blue | Fluka | 93595 | Trypan blue to adjust phantom light propagation |
Cy7 | Lumiprobe | 15020 | Fluorochrome for the phantom inclusions |
Lipovenoes 20% | Fresenius Kabi | 3094740 | Lipid emulsion, scattering agent for FMT contrast agents |
Definiens Developer XD Server | Definiens AG | Server XD | Software platform for automated segmentation |
Imalytics Preclinical | ExMI/Gremse-IT | Version 2.0.1 | Software for image fusion, reconstruction and analysis |
NVIDIA Geforce Titan | Asus | GTXTITAN6GD5 | High end computer graphics card, 6GB Memory |