ניתוח הפונקציות של תאי פיטום ב Vivo באמצעות 'תא התורן לדפוק ב' עכברים
Summary
אנו מתארים שיטה ליצירת תאי פיטום שמקורם במבחנה, חריטה שלהם לעכברים חסרי תאים תורניים, וניתוח של פנוטיפ, מספרים והפצה של תאי פיטום חרוטים באתרים אנטומיים שונים. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להעריך את הפונקציות של תאי פיטום ב vivo.
Abstract
תאי פיטום (MCs) הם תאים hematopoietic אשר שוכנים ברקמות שונות, והם שופעים במיוחד באתרים חשופים לסביבה החיצונית, כגון עור, דרכי הנשימה ומערכת העיכול. ידוע בעיקר בשל תפקידם המזיק בתגובות אלרגיות תלויות IgE, MCs הופיעו גם כשחקנים חשובים בהגנה המארחת מפני ארס ופלש חיידקים ולטפילים. פנוטיפ MC ותפקוד יכול להיות מושפע גורמים microenvironmental שעשויים להיות שונים בהתאם למיקום האנטומי ו / או מבוסס על סוג או שלב ההתפתחות של תגובות חיסוניות. מסיבה זו, אנחנו ואחרים העדפנו בגישות vivo על פני שיטות במבחנה כדי לקבל תובנה פונקציות MC. כאן, אנו מתארים שיטות ליצירת MCs מתורבתים של מח עצם העכבר (BMCMCs), העברתם המאמצת לעכברים לקויי MC גנטית, וניתוח המספרים וההתפלגות של MCs שהועברו באופן מאמץ באתרים אנטומיים שונים. שיטה זו, בשם‘תא התורן knock-in’ גישה, נעשה שימוש נרחב במהלך 30 השנים האחרונות כדי להעריך את הפונקציות של MCs ומוצרים שמקורם MC ב vivo. אנו דנים ביתרונות ובמגבלות של שיטה זו, לאור גישות חלופיות שפותחו בשנים האחרונות.
Introduction
תאי פיטום (MCs) הם תאים hematopoietic הנובעים אבות מח עצם פלוריפוטנטי1-3. בעקבות יציאה מח עצם, MCs אבות נודדים לתוך רקמות שונות שבו הם מתפתחים לתוך MCs בוגרת תחת השפעת גורמי גדילה מקומיים1-3. MCs תושבי רקמות ממוקמים אסטרטגית בממשקי סביבה מארחת, כגון העור, דרכי הנשימה ומערכת העיכול, שם הם מתנהגים כקו הגנה ראשון מפני עלבונות חיצוניים3-6. MCs מסווגים לעתים קרובות על סמך המאפיינים הפנוטיפיים “הבסיסיים” שלהם והמיקומים האנטומיים שלהם. בעכברים תוארו שני סוגים של MCs: MCs מסוג “רקמת חיבור” (CTMCs) ומחשבי MCs הרירית (MMCs)1-3,7,8. CTMCs ממוקמים לעתים קרובות סביב venules ליד סיבי עצב, ומתגוררים בחללים serosal, בעוד MMCs לכבוש מיקומים תוך-אפיתל במעיים רירית הנשימה1-3.
מתודולוגיות רבות יושמו כדי ללמוד פונקציות ביולוגיות של MCs9-13. קבוצות רבות התמקדו בגישות במבחנה באמצעות קווי תאים (כגון הקווים האנושיים MC HMC114 או LAD215,16), IN VITRO נגזר MCs (כגון MCs נגזר דם היקפי אנושי17, או עצם העכבר נגזר תרבית MCs [BMCMCs]18, MCs בתרבית עור עוברי [FSCMCs]19 ומחשבים גרפיים [PCMCs]20) או MCs מבודדים ex vivo מאתרים אנטומיים שונים. כל המודלים האלה נמצאים בשימוש נרחב כדי ללמוד פרטים מולקולריים של ביולוגיה MC, כגון איתות מסלולים המעורבים בהפעלת MC. עם זאת, היבט חשוב של הביולוגיה MCs הוא כי המאפיינים הפנוטיפיים והפונקציונליים שלהם (למשל,תוכן פרוטאז גרנול ציטופלסמי או תגובה לגירויים שונים) ניתן לווסת על ידי מיקום אנטומי microenvironment2,7. מאז התערובת המדויקת של גורמים כאלה כי הם נתקלים vivo עשוי להיות קשה לשחזר במבחנה, אנו מעדיפים להשתמש בגישות vivo כדי לקבל תובנות פונקציות MCs9.
קיימים מספר זנים של עכברים עם מחסור גנטי ב- MC, כגון עכברי WBB6F1–קיט W/W-v או C57BL/6-קיט W-sh/W-sh. עכברים אלה חסרים ביטוי ו/או פעילות של KIT (CD117), הקולטן של גורם הגדילה העיקרי של MC גורם תאי גזע (SCF)21,22. כתוצאה מכך, לעכברים אלה יש מחסור עמוק ב- MC אך יש להם גם חריגות פנוטיפיות נוספות הקשורות למוטציותערכת c שלהם (ב- WBB6F1–קיט W / W-v עכברים) או להשפעות של היפוך כרומוזומלי גדול שתוצאתוביטוי ערכת c מופחתת (ב C57BL / 6 –קיט W-sh / W-sh עכברים)9,10,12,23. לאחרונה, מספר זנים של עכברים עם c-קיט– מחסור עצמאי MC מכונן דווחו24-26. כל העכברים האלה וכמה סוגים חדשים נוספים של עכברים חסרי השכלה MC נבדקו לאחרונה בפירוט9,10,13.
כאן, אנו מתארים שיטות ליצירת MCs מתורבתים שמקורם בעצם העכבר (BMCMCs), העברתם המאמצת לעכברים חסרי MC וניתוח המספרים וההתפלגות של MCs שהועברו באופן מאמץ באתרים אנטומיים שונים. שיטה זו שנקראת ‘תא התורן לדפוק ב’ ניתן להשתמש כדי להעריך את הפונקציות של MCs ומוצרים שמקורם MC ב vivo. אנו דנים ביתרונות ובמגבלות של שיטה זו, לאור גישות חלופיות שפותחו בשנים האחרונות.
Protocol
Representative Results
Discussion
כמעט 30 שנה לאחר תיאורו הראשוני38, הגישה ‘תא התורן לדפוק ב‘ ממשיכה לספק מידע רב ערך על מה MCs יכול לעשות או לא יכול לעשות vivo. הפונקציות של MCs נחשבו זמן רב להיות מוגבל לתפקידם באלרגיה. נתונים שנוצרו באמצעות גישת ‘תא התורן knock-in‘ שינו השקפה זו, על ידי מתן ראיות כי MCs יכול, בין היתר, …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
N.G. הוא מקבל מלגות מן הצרפתית “פונדציה לשפוך la Recherche Médicale FRM” וקרן פיליפ; R.S. נתמך על ידי קרן לוסיל פקארד לבריאות הילדים ופרס סטנפורד NIH / NCRR CTSA מספר UL1 RR025744; נ.ב. נתמך על ידי מלגת מקס קייד של קרן מקס קייד והאקדמיה האוסטרית למדעים ומלגת שרודינגר של קרן המדע האוסטרית (FWF): J3399-B21; S.J.G. מכיר בתמיכה של המכונים הלאומיים לבריאות מעניק U19 AI104209, NS 080062 ומהתוכנית לחקר מחלות הקשורות לטבק באוניברסיטת קליפורניה; L.L.R. מכיר בתמיכה של קרן המחקר הלאומית דלקת פרקים (ANRF) ומכוני הבריאות הלאומיים מענק K99AI110645.
Materials
| 1% Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning cellgro | 30-004-Cl | |
| 3 ml Syringe | Falcon | 309656 | |
| 35 mm x 10 mm Dish | Corning cellgro | 430588 | |
| 5 ml Polystyrene Round Bottom Tube | Falcon | 352058 | |
| Acetic Acid Glacial | Fisher Scientific | A35-500 | |
| Alcian Blue 8GX | Rowley Biochemical Danver | 33864-99-2 | |
| Allegra 6R Centrifuge | Beckman | ||
| Anti-mouse CD16/32 (clone 93) Purified | eBioscience | 14-0161-81 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M7522 | |
| BD 1 ml TB Syringe | BD Syringe | 309659 | |
| BD 22G x1 (0.7 mm x 25 mm) Needles | BD Precision Glide Needle | 205155 | |
| BD 25G 5/8 Needles | BD Syringe | 305122 | |
| BD 30G x1/2 Needles | BD Precision Glide | 305106 | |
| Blue MAX Jr, 15 ml Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352097 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-500 | |
| Cytoseal 60 Mounting Medium | Richard-Allan Scientific | 8310-4 | |
| Cytospin3 | Shandon | NA | |
| DakoCytomation pen | Dako | S2002 | |
| Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1x | Corning cellgro | 15-013-CM | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E 7023-500ml | |
| Fetal Bovine Serum Heat Inactivated | Sigma Aldrich | F4135-500ml | |
| FITC Conjugated IgG2b K Rat Isotype Control | eBioscience | 14-4031-82 | |
| Fluorescein Isotiocyanate (FITC) Conjugated Anti-mouse KIT (CD117; clone 2B8) | eBioscience | 11-1171-82 | |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | F79-500 | |
| Giemsa Stain Modified | Sigma Aldrich | GS-1L | |
| Isothesia | Henry Schein Animal Health | 29405 | |
| May-Grunwald Stain | Sigma Aldrich | MG-1L | |
| Multiwell 6 well plates | Falcon | 35 3046 | |
| Olympus BX60 Microscope | Olympus | NA | |
| Paraplast Plus Tissue Embedding Medium | Fisher Brand | 23-021-400 | |
| PE Conjugated IgG Armenian Hamster Isotype Control | eBioscience | 12-4888-81 | |
| Phosphate-Buffered-Saline (PBS) 1x | Corning cellgro | 21-040-CV | |
| Phycoerythrin (PE) Conjugated Anti-mouse FceRIa (clone MAR-1) | eBioscience | 12-5898-82 | |
| Propidium Iodide Staining Solution | eBioscience | 00-6990-50 | |
| Recombinant Mouse IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| Safranin-o Certified | Sigma Aldrich | S8884 | |
| Tissue culture flasks T25 25 cm2 | Beckton Dickinson | 353109 | |
| Tissue culture flasks T75 75 cm2 | Beckton Dickinson | 353110 | |
| Toluidine Blue 1 % Aqueous | LabChem-Inc | LC26165-2 | |
| Recombinant Mouse SCF | Peprotech | 250-03 |
Referenzen
- Kitamura, Y. Heterogeneity of mast cells and phenotypic change between subpopulations. Annu. Rev. Immunol. 7, 59-76 (1989).
- Galli, S. J., Borregaard, N., Wynn, T. A. Phenotypic and functional plasticity of cells of innate immunity: macrophages, mast cells and neutrophils. Nat. Immunol. 12, 1035-1044 (2011).
- Gurish, M. F., Austen, K. F. Developmental origin and functional specialization of mast cell subsets. Immunity. 37, 25-33 (2012).
- Abraham, S. N., St John, A. L. Mast cell-orchestrated immunity to pathogens. Nat. Rev. Immunol. 10, 440-452 (2010).
- Galli, S. J., Grimbaldeston, M., Tsai, M. Immunomodulatory mast cells: negative, as well as positive, regulators of immunity. Nat. Rev. Immunol. 8, 478-486 (2008).
- Reber, L. L., Frossard, N. Targeting mast cells in inflammatory diseases. Pharmacol. Ther. 142, 416-435 (2014).
- Galli, S. J. Mast cells as ‘tunable’ effector and immunoregulatory cells: recent advances. Ann. Rev. Immunol. 23, 749-786 (2005).
- Moon, T. C. Advances in mast cell biology: new understanding of heterogeneity and function. Mucosal Immunol. 3, 111-128 (2010).
- Reber, L. L., Marichal, T., Galli, S. J. New models for analyzing mast cell functions in vivo. Trends Immunol. 33, 613-625 (2012).
- Rodewald, H. R., Feyerabend, T. B. Widespread immunological functions of mast cells: fact or fiction. Immunity. 37, 13-24 (2012).
- Siebenhaar, F. The search for Mast Cell and Basophil models – Are we getting closer to pathophysiological relevance. Allergy. , (2014).
- Tsai, M., Grimbaldeston, M. A., Yu, M., Tam, S. Y., Galli, S. J. Using mast cell knock-in mice to analyze the roles of mast cells in allergic responses in vivo. Chem. Immunol. Allergy. 87, 179-197 (2005).
- Galli, S. J., et al. Approaches for analyzing the roles of mast cells and their proteases in vivo. Adv. Immunol. , (2015).
- Butterfield, J. H., Weiler, D., Dewald, G., Gleich, G. J. Establishment of an immature mast cell line from a patient with mast cell leukemia. Leuk. Res. 12, 345-355 (1988).
- Kirshenbaum, A. S. Characterization of novel stem cell factor responsive human mast cell lines LAD 1 and 2 established from a patient with mast cell sarcoma/leukemia; activation following aggregation of FcepsilonRI or FcgammaRI. Leuk. Res. 27, 677-682 (2003).
- Sibilano, R. The aryl hydrocarbon receptor modulates acute and late mast cell responses. J. Immunol. 189, 120-127 (2012).
- Gaudenzio, N., Laurent, C., Valitutti, S., Espinosa, E. Human mast cells drive memory CD4+ T cells toward an inflammatory IL-22+ phenotype. J. Allergy Clin. Immunol. 131, 1400-1407 (2013).
- Tertian, G., Yung, Y. P., Guy-Grand, D., Moore, M. A. Long-term in vitro. culture of murine mast cells. I. Description of a growth factor-dependent culture technique. J. Immunol. 127, 788-794 (1981).
- Yamada, N., Matsushima, H., Tagaya, Y., Shimada, S., Katz, S. I. Generation of a large number of connective tissue type mast cells by culture of murine fetal skin cells. J. Invest. Dermatol. 121, 1425-1432 (2003).
- Malbec, O. Peritoneal cell-derived mast cells: an in vitro. model of mature serosal-type mouse mast cells. J. Immunol. 178, 6465-6475 (2007).
- Galli, S. J., Zsebo, K. M., Geissler, E. N. The Kit ligand, stem cell factor. Adv. Immunol. 55, 1-96 (1994).
- Reber, L., Da Silva, C. A., Frossard, N. Stem cell factor and its receptor c-Kit as targets for inflammatory diseases. Eur. J. Pharmacol. 533, 327-340 (2006).
- Grimbaldeston, M. A. Mast cell-deficient W.-sash. c-kit. mutant KitW.-sh./W.-sh. mice as a model for investigating mast cell biology in vivo. Am. J. Pathol. 167, 835-848 (2005).
- Lilla, J. N. Reduced mast cell and basophil numbers and function in Cpa3-Cre Mcl-1.fl/fl. mice. Blood. 118, 6930-6938 (2011).
- Dudeck, A. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34, 973-984 (2011).
- Feyerabend, T. B. Cre-Mediated Cell Ablation Contests Mast Cell Contribution in Models of Antibody and T Cell-Mediated Autoimmunity. Immunity. 35, 832-844 (2011).
- Schafer, B. Mast cell anaphylatoxin receptor expression can enhance IgE-dependent skin inflammation in mice. J. Allergy Clin. Immunol. 131, 541-548 (2013).
- Akahoshi, M. Mast cell chymase reduces the toxicity of Gila monster venom, scorpion venom, and vasoactive intestinal polypeptide in mice. J. Clin. Invest. 121, 4180-4191 (2011).
- Grimbaldeston, M. A., Nakae, S., Kalesnikoff, J., Tsai, M., Galli, S. J. Mast cell-derived interleukin 10 limits skin pathology in contact dermatitis and chronic irradiation with ultraviolet B. Nat. Immunol. 8, 1095-1104 (2007).
- Hershko, A. Y. Mast cell interleukin-2 production contributes to suppression of chronic allergic dermatitis. Immunity. 35, 562-571 (2011).
- Metz, M. Mast cells can enhance resistance to snake and honeybee venoms. Science. 313, 526-530 (2006).
- Nakahashi-Oda, C. Apoptotic cells suppress mast cell inflammatory responses via the CD300a immunoreceptor. J. Exp. Med. 209, 1493-1503 (2012).
- Piliponsky, A. M. Neurotensin increases mortality and mast cells reduce neurotensin levels in a mouse model of sepsis. Nat. Med. 14, 392-398 (2008).
- Chan, C. Y., St John, A. L., Abraham, S. N. Mast cell interleukin-10 drives localized tolerance in chronic bladder infection. Immunity. 38, 349-359 (2013).
- Yu, M. Mast cells can promote the development of multiple features of chronic asthma in mice. J. Clin. Invest. 116, 1633-1641 (2006).
- Reber, L. L., Daubeuf, F., Pejler, G., Abrink, M., Frossard, N. Mast cells contribute to bleomycin-induced lung inflammation and injury in mice through a chymase/mast cell protease 4-dependent mechanism. J. Immunol. 192, 1847-1854 (2014).
- Lee, D. M. Mast cells: a cellular link between autoantibodies and inflammatory arthritis. Science. 297, 1689-1692 (2002).
- Nakano, T. Fate of bone marrow-derived cultured mast cells after intracutaneous, intraperitoneal, and intravenous transfer into genetically mast cell-deficient W/W-v. mice. Evidence that cultured mast cells can give rise to both connective tissue type and mucosal mast cells. J. Exp. Med. 162, 1025-1043 (1985).
- Malaviya, R., Ikeda, T., Ross, E., Abraham, S. N. Mast cell modulation of neutrophil influx and bacterial clearance at sites of infection through TNF-alpha. Nature. 381, 77-80 (1996).
- Lu, L. F. Mast cells are essential intermediaries in regulatory T-cell tolerance. Nature. 442, 997-1002 (2006).
- Tsai, M., Tam, S. Y., Wedemeyer, J., Galli, S. J. Mast cells derived from embryonic stem cells: a model system for studying the effects of genetic manipulations on mast cell development, phenotype, and function in vitro. and in vivo. Int. J. Hematol. 75, 345-349 (2002).
- Nocka, K., Buck, J., Levi, E., Besmer, P. Candidate ligand for the c-kit transmembrane kinase receptor: KL, a fibroblast derived growth factor stimulates mast cells and erythroid progenitors. EMBO J. 9, 3287-3294 (1990).
- Tsai, M. Induction of mast cell proliferation, maturation, and heparin synthesis by the rat c-kit ligand, stem cell. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 88, 6382-6386 (1991).
- Ronnberg, E., Calounova, G., Guss, B., Lundequist, A., Pejler, G. Granzyme D is a novel murine mast cell protease that is highly induced by multiple pathways of mast cell activation. Infect. Immun. 81, 2085-2094 (2013).
- Ito, T. Stem cell factor programs the mast cell activation phenotype. J. Immunol. 188, 5428-5437 (2012).
- Furuta, G. T., Ackerman, S. J., Lu, L., Williams, R. E., Wershil, B. K. Stem cell factor influences mast cell mediator release in response to eosinophil-derived granule major basic protein. Blood. 92, 1055-1061 (1998).
- Weller, K., Foitzik, K., Paus, R., Syska, W., Maurer, M. Mast cells are required for normal healing of skin wounds in mice. FASEB J. 20, 2366-2368 (2006).
- McLachlan, J. B. Mast cell activators: a new class of highly effective vaccine adjuvants. Nat. Med. 14, 536-541 (2008).
- Reber, L. L. Contribution of mast cell-derived interleukin-1b to uric acid crystal-induced acute arthritis in mice. Arthritis Rheumatol. 66, 2881-2891 (2014).
- Arac, A. Evidence that Meningeal Mast Cells Can Worsen Stroke Pathology in Mice. Am. J. Pathol. 184, 2493-2504 (2014).
- Christy, A. L., Walker, M. E., Hessner, M. J., Brown, M. A. Mast cell activation and neutrophil recruitment promotes early and robust inflammation in the meninges in EAE. J. autoimmun. 42, 50-61 (2013).
- Hammel, I., Lagunoff, D., Galli, S. J. Regulation of secretory granule size by the precise generation and fusion of unit granules. J. Cell. Mol. Med. 14, 1904-1916 (2010).
- Martin, T. R. Mast cell activation enhances airway responsiveness to methacholine in the mouse. J. Clin. Invest. 91, 1176-1182 (1993).
- Tanzola, M. B., Robbie-Ryan, M., Gutekunst, C. A., Brown, M. A. Mast cells exert effects outside the central nervous system to influence experimental allergic encephalomyelitis disease course. J. Immunol. 171, 4385-4391 (2003).
- Wolters, P. J. Tissue-selective mast cell reconstitution and differential lung gene expression in mast cell-deficient Kit.W-sh/W-sh. sash mice. Clin. Exp Allergy. 35, 82-88 (2005).
- Reber, L. L. Selective ablation of mast cells or basophils reduces peanut-induced anaphylaxis in mice. J. Allergy Clin. Immunol. 132, 881-888 (2013).
- Hara, M. Evidence for a role of mast cells in the evolution to congestive heart failure. J. Exp. Med. 195, 375-381 (2002).
- Abe, T., Nawa, Y. Localization of mucosal mast cells in W/W-v. mice after reconstitution with bone marrow cells or cultured mast cells, and its relation to the protective capacity to Strongyloides ratti. infection. Parasite Immunol. 9, 477-485 (1987).
- Groschwitz, K. R. Mast cells regulate homeostatic intestinal epithelial migration and barrier function by a chymase/Mcpt4-dependent mechanism. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22381-22386 (2009).
- Wedemeyer, J., Galli, S. J. Decreased susceptibility of mast cell-deficient Kit.W/W-v. mice to the development of 1, 2-dimethylhydrazine-induced intestinal tumors. Lab. Invest. 85, 388-396 (2005).
- Sawaguchi, M. Role of mast cells and basophils in IgE responses and in allergic airway hyperresponsiveness. J. Immunol. 188, 1809-1818 (2012).
- Piliponsky, A. M. Mast cell-derived TNF can exacerbate mortality during severe bacterial infections in C57BL/6-Kit.W-sh/W-sh. mice. Am. J. Pathol. 176, 926-938 (2010).
- Shelburne, C. P. Mast cells augment adaptive immunity by orchestrating dendritic cell trafficking through infected tissues. Cell Host Microbe. 6, 331-342 (2009).
- Michel, A. Mast cell-deficient Kit.W-sh. ‘Sash’ mutant mice display aberrant myelopoiesis leading to the accumulation of splenocytes that act as myeloid-derived suppressor cells. J. Immunol. 190, 5534-5544 (2013).
- Becker, M. Genetic variation determines mast cell functions in experimental asthma. J. Immunol. 186, 7225-7231 (2011).
- Abram, C. L., Roberge, G. L., Hu, Y., Lowell, C. A. Comparative analysis of the efficiency and specificity of myeloid-Cre deleting strains using ROSA-EYFP reporter mice. J. Immunol. Methods. 408, 89-100 (2014).
