CXCR6.Gfp Muhabir Fare kullanma Sağlıklı ve hastalıklı Karaciğer Bağışıklık Hücreleri Uzun Vadeli intravital multiphoton Mikroskopi Görüntüleme
Summary
Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.
Abstract
Yaralanmaya yanıt olarak karaciğer iltihabı, monositler, nötrofiller, T hücresi alt kümelerinin, B hücreleri, doğal katil (NK) ve NKT hücreleri de dahil olmak üzere, lökositlerin farklı alt süzmeyi söz konusu eden bir yüksek dinamik bir süreçtir. Bağışıklık hücre göçü izlemek için karaciğer intravital mikroskopi, numune hazırlama ve fiksasyon, optik çözünürlük ve uzun süreli hayvan yaşam konusunda yüksek gereksinimleri özellikle zordur. Ancak, inflamatuar süreçler yanı sıra hücresel etkileşim çalışmaları dinamikleri daha iyi inflamatuar karaciğer hastalığı başlatılması, ilerlemesini ve gerileme anlamak için kritik bilgiler verebilir. Bu nedenle, son derece hassas ve güvenilir bir yöntem yoğun bakım ile kombinasyon halinde göç ve intravital iki-fotonlu lazer tarama mikroskobu (TPLSM) uzun bir süre (yaklaşık 6 saat) fare karaciğer, farklı bağışıklık hücreleri, hücre-hücre etkileşimini incelemek için kurulmuştur izlenmesi.
esi "> Resim yöntem yumuşak bir hazırlama ve organın en az pertürbasyon ile karaciğerin stabil bir sabitleme içeren, uzun süreli intravital görüntüleme izleme sağlayan, en fazla 6 saat arasında bir zaman dilimi boyunca hemen hemen hiçbir ışıkla ağartma ya da fototoksik etkileri ile çok renkli multiphoton mikroskopi kullanılarak ve fare hayati parametreleri ve dolaşım, sıcaklık ve gaz değişimi istikrar geniş izleme nedeniyle istikrarlı görüntüleme koşulları, özel lökosit alt gruplarının.CXCR6.gfp karaciğer iltihabı üzerine lenfosit göçünü araştırmak knock-in farelerde bazal şartlar altında ve karbon tetraklorid, periton içine enjekte (ler) i (CCl4) neden olduğu akut ve kronik karaciğer hasarı sonrası intravital karaciğer görüntüleme tabi tutuldu.
Doğal Katil (NK) – – ve aynı zamanda, CD4 T hücreleri gibi T lenfositlerinin alt grupları fakat mukozal Associ CXCR6 esas Doğal Katil T (NKT) lenfositlerin eksprese edilen bir kemokin alıcısı, birated değişmez (MAIT) T hücreleri 1. Bir karaciğer hasarı üzerine kendi değişmiş davranış içine ayrıntılı fikir ve hastalığın ilerlemesinde dolayısıyla potansiyel katılımı izin CXCR6.gfp + bağışıklık hücrelerinin göç desen ve konumlandırma ardından.
Introduction
hücre ve bütün organlarda hücresel fonksiyonlar ya da hatta bütün bir organizma görselleştirme gövde 2'nin hemen hemen tüm parçaları dahil olmak üzere, 50 yıldan fazla bir büyük bir ilgi olmuştur. Bu nedenle, bazı erken çalışmalar zaten karaciğer 3,4 intravital görüntüleme istihdam. Ancak, çeşitli sınırlamalar karaciğer dokusunun uzun vadeli istikrarlı yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile ilgili güncel var.
Nedeniyle diyafram ve gastrointestinal sistem 5 ile yakın temas içinde karaciğer anatomik pozisyonuna, mikroskobik intravital görüntüleme için en yaygın sorun, bağırsak 6 daha az bir ölçüde, peristaltik hareket solunum nedeniyle ve. Diğer katı organlara kıyasla, karaciğer cerrahisi özellikle zordur. Nedeniyle yoğun mikrovasküler yapı, cerrahi manipülasyon, masif hemorajik lezyonlar ikamet bozulmuş mikrosirkülasyon 7 ve ayrıca aktivasyonunu yol açabilir iBu tür Kupffer hücrelerinde 8 olarak mmune hücreleri. Bu nedenle, doku mekanik tespit 6,9 intravital mikroskopi görüntüleme ile müdahale muhtemeldir yerde yayınlanan.
Sağlıklı bir karaciğer toplam kan hacminin% 10-15 karaciğer damar içinde bulunduğu, ve organ dolaşımdaki değişiklikler (örneğin, kan basıncı dalgalanmaları oldukça duyarlı bir organ oluşturma, genel kalp debisi 10 civarında% 25 alır ). Bu nedenle, aşırı doku işleme veya merkezi dolaşımı yoluyla örneğin, kayma gerilmesi, yerinden, yaralanma hepatik kan akımı aksamalar yanı sıra karaciğer bağışıklık yanıtları etkileyen, lökosit göç davranışı yapay değişiklikler, bozulmuş karaciğer oksijenlenme ve bu nedenle daha fazla karaciğer hasarına yol açacaktır organ koruyucu ve hayvanın genel yaşam süresidir.
Erken mikroskobik çalışmalar Intravital epifloresans mi dayanmaktadırcroscopy, ancak böyle bir fotoğraf ağartma ve düşük penetrasyon derinliği gibi çeşitli teknik kısıtlamalar uzun vadeli karaciğer görüntüleme 4,11,12 için bu tekniğin kullanımını sınırlamak. Bu yeni yöntem, gerçek yaşam durumları 13-15 altında hemen hemen tüm organlarda görüntüleme çalışmaları gerçekleştirmek için teknik yetenekli olduğu gibi 1990'larda multiphoton mikroskopi gelişmesiyle birlikte, fotoğraf beyazlatma veya penetrasyon derinliği sınırlamalar çoğunlukla, çözüldü. Ancak, karaciğer görüntülemesi açısından ana kalan zorluklar vardı: birkaç saat 16 daha uzun süre hepatik Sinüsoidlerde değiştirilmemiş kan akışını ve özellikle kararlı görüntüleme güvence nefes hareketleri, karaciğer dokusunun otofloresansı.
Çeşitli çalışmalar karaciğer 17, örneğin, NKT hücreleri 18-20, T hücreleri 21,22, karaciğer makrofajlar 23,24 veya nötrofiller 25, uzun vadeli multiphoton m fonksiyonu ve çeşitli lökositlerin göçünü ele rağmenicroscopy görüntüleme henüz başarılı nedeniyle daha fazla hasara 26 mevcut hasar ve dolayısıyla daha yüksek duyarlılığa bir görev daha zorlu akut veya kronik karaciğer hastalığı olan hayvanlarda, kurulmuş olmasaydı. Ancak, gerçek zamanlı olarak karaciğerde lökositlerin göç davranışlarını ve hücresel fonksiyonu izleme karaciğer homeostazı ve hastalık 27 kendi özel rolü yeni bakış açıları sağlar.
Kemokin reseptörü CXCR6, doğal öldürücü (NK) hücreler, NKT hücreleri ve bazı T hücresi popülasyonları 18,28 dahil olmak üzere birçok lenfosit alt, ifade edilir. Farelerde Önceki çalışmalar CXCR6 ve aynı kökenli bağ CXCL16 homeostazı karaciğer sinüsoidlerinden üzerinde NKT hücrelerinin devriye kontrol olabileceğini göstermiştir. Sonuç olarak, (CXCR6 lokusunda yeşil floresan protein [GFP] bir knock-in taşıyan) CXCR6.gfp farelerin kullanılması, beyin 29 gibi çeşitli organ lenfosit göçünü araştırmak için tarif edilmiştirve ayrıca karaciğer 18,20, enflamasyon üzerine CXCR6.gfp hücrelerin infiltrasyonunu artış göstererek.
Bu çalışmada verilen yöntemle stabilize koşullar altında uzun bir süre boyunca, bu işlemleri takip edilmesi mümkün olmuştur. Intravital multiphoton bazlı prosedür hayvan ve organın minimal pertürbasyon ile son derece tekrarlanabilir oldu görüntüleme izin; solunum ve dolaşım yakın kontrolü ardından geniş izleme uzun süreli hayvan yaşam için optimize edilmiş; ve son derece esnek ve kolay gibi böbrek veya dalak gibi diğer parankimal organlarda da benimsemeye.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmanın amacı, karaciğer intravital TPLSM görüntüleme için yüksek ölçüde standardize edilmiş stabil ve tekrarlanabilir bir yöntem geliştirmektir. Genel Intravital görüntüleme hedeflemesi ve geliştirme, homeostasis ve hastalığın farklı lökosit popülasyonlarının etkileşimi aşağıdaki gerçek hayat koşullarında hücresel davranış içine değerli anlayışlar verdi. Ancak, doğrudan diğer katı organlara kıyasla karaciğer yanı sıra yüksek kırılganlık aktarılır hangi neden…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank the Central Animal facility of the University Hospital Aachen for technical support. This work was supported by the German Research Foundation (DFG Ta434/2-1, DFG SFB/TRR 57) and by the Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Aachen. This work was further supported by the Core Facility ”Two-Photon Imaging”, a Core Facility of the Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Aachen within the Faculty of Medicine at RWTH Aachen University.
Materials
| Anesthetics | |||
| Buprenorphine | Essex Pharma | 997.00.00 | Analgeticum, 0.1 mg/kg |
| Fentanyl | Rotex Medica | charge: 30819 | |
| Fluovac anesthesia system | Harvard Apparatus | 34-1030 | |
| Glucose 5% | Braun | ||
| ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser | Eickemeyer | 4802885 | |
| Isoflurane | Forene Abbott | B 506 | |
| Isotonic (0.9%) NaCl solution | DeltaSelect GmbH | PZN 00765145 | |
| Ketamin 10% | ceva | Charge: 36217/09 | |
| Xylazin 2% | medistar | Charge: 04-03-9338/23 | |
| Consumable supplies | |||
| 20ml Syringe | BD Plastipak | ||
| 250ml Erlenmeyer flask | Schott Duran | 21 226 36 | |
| 25mL Beaker 2x | Schott Duran | 50-1150 | |
| 2ml syringe | BD Plastipak | ||
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | V7980 | |
| Agarose | commercially available | ||
| Bepanthen Eye and Nose ointment | Bayer Vital GmbH | 6029009.00.00 | |
| Change-A-Tip Deluxe High-Temp Cautery Kit | Fine Science Tools Inc. | 18010-00 | |
| Cotton Gauze swabs | Fuhrmann GmbH | 32014 | |
| Cover Slip 24x50mm | ROTH | 1871 | |
| Durapore silk tape | 3M | 1538-1 | |
| Feather disposable scalpel | Feather | 02.001.30.011 | |
| Fine Bore Polythene Tubing 0,58mm ID | Smiths medical | 800/100/200 | |
| Histoacryl | Braun | 1050052 | 5x 0,5ml |
| Leukoplast | BSN Medical Inc. | ||
| Microscope Slides | ROTH | 1879 | |
| Poly-Alcohol Haut…farblos Antisepticum | Antiseptica GmbH | 72PAH200 | |
| Sterican needle 18 G x 1 | B. Braun | 304622 | |
| Sterican needle 27 3/4 G x 1 | B. Braun | 4657705 | |
| Tissue paper | commercially available | ||
| Surgical Instruments | |||
| Amalgam burnisher 3PL | Gatz | 0110? | |
| Blair retractors (4 pronged (blunt)) x2 | Storz&Klein | S-01134 | |
| Dumont No.7 forceps | Fine Science Tools Inc. | 91197-00 | |
| Graefe forceps curved x1 | Fine Science Tools Inc. | 11151-10 | |
| Graefe forceps straight x2 | Fine Science Tools Inc. | 11050-10 | |
| Heidemann spatula HD2 | Stoma | 2030.00 | |
| Needle holder Mathieu | Fine Science Tools Inc. | 12010-14 | |
| Scissor | Fine Science Tools Inc. | 14074-11 | |
| Semken forceps | Fine Science Tools Inc. | 11008-13 | |
| Small surgical scissors curved | Fine Science Tools Inc. | 14029-10 | |
| Small surgical scissors straight | Fine Science Tools Inc. | 14028-10 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools Inc. | 11000-12 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools Inc. | 15000-08 | |
| Equipment | |||
| ECG Trigger Unit | Rapid Biomedical | 3000003686 | |
| MICROCAPSTAR End-Tidal Carbon Dioxide Analyzer | AD Instruments | ||
| Minivent Typ 845 | Harvard Apparatus | 73-0043 | |
| Multiphoton microscope Trimscope I | LaVision | ||
| Perfusor Compact | B. Braun | ||
| PowerLab 8/30 8 channel recorder | AD Instruments | PL3508 | |
| Temperature controlled heating pad | Sygonix | 26857617 | |
| Temperature sensor | comercially available | ||
| Temperature controlled System for Microscopes -Cube&Box | Life Imaging Services |
Referenzen
- Dusseaux, M., et al. Human MAIT cells are xenobiotic-resistant, tissue-targeted, CD161hi IL-17-secreting T cells. Blood. 117 (4), 1250-1259 (2011).
- Reese, A. J. The effect of hypoxia on liver secretion studied by intravital fluorescence microscopy. Br J Exp Pathol. 41, 527-535 (1960).
- Bhathal, P. S., Christie, G. S. Intravital fluorescence microscopy study of bile ductule proliferation in guinea pigs. Gut. 10 (11), 955 (1969).
- Stefenelli, N. Terminal vascular system and microcirculation of the rat liver in intravital microscopy. Wien Klin Wochenschr. 82 (33), 575-578 (1970).
- Hori, T., et al. Simple and sure methodology for massive hepatectomy in the mouse. Ann Gastroenterol. 24 (4), 307-318 (2011).
- Tanaka, K., et al. Intravital dual-colored visualization of colorectal liver metastasis in living mice using two photon laser scanning microscopy. Microsc Res Tech. 75 (3), 307-315 (2011).
- Schemmer, P., Bunzendahl, H., Klar, E., Thurman, R. G. Reperfusion injury is dramatically increased by gentle liver manipulation during harvest. Transpl Int. 13, S525-S527 (2000).
- Schemmer, P., et al. Activated Kupffer cells cause a hypermetabolic state after gentle in situ manipulation of liver in rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 280 (6), G1076-G1082 (2001).
- Toiyama, Y., et al. Intravital imaging of DSS-induced cecal mucosal damage in GFP-transgenic mice using two-photon microscopy. J Gastroenterol. 45 (5), 544-553 (2010).
- Zimmon, D. S. The hepatic vasculature and its response to hepatic injury: a working hypothesis. Yale J Biol Med. 50 (5), 497-506 (1977).
- Wong, J., et al. A minimal role for selectins in the recruitment of leukocytes into the inflamed liver microvasculature. J Clin Invest. 99 (11), 2782-2790 (1997).
- Bonder, C. S., et al. Essential role for neutrophil recruitment to the liver in concanavalin A-induced hepatitis. J Immunol. 172 (1), 45-53 (2004).
- Xu, C., Zipfel, W., Shear, J. B., Williams, R. M., Webb, W. W. Multiphoton fluorescence excitation: new spectral windows for biological nonlinear microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (20), 10763-10768 (1996).
- Centonze, V. E., White, J. G. Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging. Biophys J. 75 (4), 2015-2024 (1998).
- Amore, J. D., et al. In vivo multiphoton imaging of a transgenic mouse model of Alzheimer disease reveals marked thioflavine-S-associated alterations in neurite trajectories. J Neuropathol Exp Neurol. 62 (2), 137-145 (2003).
- Hickey, M. J., Westhorpe, C. L. V. Imaging inflammatory leukocyte recruitment in kidney, lung and liver–challenges to the multi-step paradigm. Immunol Cell Biol. 91 (4), 281-289 (2013).
- McLellan, M. E., Kajdasz, S. T., Hyman, B. T., Bacskai, B. J. In vivo imaging of reactive oxygen species specifically associated with thioflavine S-positive amyloid plaques by multiphoton microscopy. J Neurosci. 23 (6), 2212-2217 (2003).
- Geissmann, F., et al. Intravascular Immune Surveillance by CXCR6+ NKT Cells Patrolling Liver Sinusoids. PLoS Biology. 3 (4), (2005).
- Velázquez, P., et al. Cutting edge: activation by innate cytokines or microbial antigens can cause arrest of natural killer T cell patrolling of liver sinusoids. J Immunol. 180 (4), 2024-2028 (2008).
- Wehr, A., et al. Chemokine receptor CXCR6-dependent hepatic NK T Cell accumulation promotes inflammation and liver fibrosis. J Immunol. 190 (10), 5226-5236 (2013).
- Khandoga, A., Hanschen, M., Kessler, J. S., Krombach, F. CD4+ T cells contribute to postischemic liver injury in mice by interacting with sinusoidal endothelium and platelets. Hepatology. 43 (2), 306-315 (2006).
- Egen, J. G., et al. Macrophage and T cell dynamics during the development and disintegration of mycobacterial granulomas. Immunity. 28 (2), 271-284 (2008).
- Beattie, L., et al. Leishmania donovani-induced expression of signal regulatory protein alpha on Kupffer cells enhances hepatic invariant NKT-cell activation. Eur J Immunol. 40 (1), 117-123 (2010).
- Beattie, L., et al. Dynamic imaging of experimental Leishmania donovani-induced hepatic granulomas detects Kupffer cell-restricted antigen presentation to antigen-specific CD8 T cells. PLoS Pathog. 6 (3), e1000805 (2010).
- McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330 (6002), 362-366 (2010).
- Vanheule, E., et al. An intravital microscopic study of the hepatic microcirculation in cirrhotic mice models: relationship between fibrosis and angiogenesis. Int J Exp Pathol. 89 (6), 419-432 (2008).
- Jenne, C. N., Kubes, P. Immune surveillance by the liver. Nat Immunol. 14 (10), 996-1006 (2013).
- Zimmermann, H. W., Tacke, F. Modification of chemokine pathways and immune cell infiltration as a novel therapeutic approach in liver inflammation and fibrosis. Inflamm Allergy Drug Targets. 10 (6), 509-536 (2011).
- Kim, J. V., et al. Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites. J Immunol Methods. 352 (1-2), 89-100 (2010).
- Karlmark, K. R., et al. Hepatic recruitment of the inflammatory Gr1+ monocyte subset upon liver injury promotes hepatic fibrosis. Hepatology. 50 (1), 261-274 (2009).
- Heymann, F., et al. Hepatic macrophage migration and differentiation critical for liver fibrosis is mediated by the chemokine receptor C-C motif chemokine receptor 8 in mice. Hepatology. 55 (3), 898-909 (2012).
- Ramachandran, P., et al. Differential Ly-6C expression identifies the recruited macrophage phenotype, which orchestrates the regression of murine liver fibrosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (46), E3186-E3195 (2012).
- Moles, A., et al. A TLR2/S100A9/CXCL-2 signaling network is necessary for neutrophil recruitment in acute and chronic liver injury in the mouse. J Hepatol. 60 (4), 782-791 (2014).
- Hammerich, L., et al. Chemokine receptor CCR6-dependent accumulation of γδ T cells in injured liver restricts hepatic inflammation and fibrosis. Hepatology. 59 (2), 630-642 (2014).
- Syn, W. -. K., et al. NKT-associated hedgehog and osteopontin drive fibrogenesis in non-alcoholic fatty liver disease. Gut. 61 (9), 1323-1329 (2012).
- McDonald, B., et al. Interaction of CD44 and hyaluronan is the dominant mechanism for neutrophil sequestration in inflamed liver sinusoids. J Exp Med. 205 (4), 915-927 (2008).
- Egen, J. G., et al. Intravital imaging reveals limited antigen presentation and T cell effector function in mycobacterial granulomas. Immunity. 34 (5), 807-819 (2011).
- Singer, G., Stokes, K. Y., Granger, D. N. Hepatic microcirculation in murine sepsis: role of lymphocytes. Pediatr Surg Int. 24 (1), 13-20 (2008).
- Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nat Med. 17 (11), 1381-1390 (2011).
- Khandoga, A. G., et al. In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue. PLoS One. 4 (3), e4693 (2009).
