Long Term intravitale Multiphoton Microscopie Beeldvorming van immuuncellen in gezonde en zieke lever behulp CXCR6.Gfp Reporter Muizen
Summary
Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.
Abstract
Lever ontsteking als reactie op letsel is een zeer dynamisch proces dat de infiltratie van verschillende subtypen van leukocyten, waaronder monocyten, neutrofielen, T-cel subsets, B-cellen, natuurlijke killer (NK) en NKT cellen. Intravitale microscopie van de lever toezicht immuun celmigratie is een bijzondere uitdaging vanwege de hoge eisen met betrekking monstervoorbereiding en fixatie, optische resolutie en langdurige dieroverleving. Toch kon de dynamiek van inflammatoire processen, alsmede cellulaire interactie onderzoeken kritische informatie om beter te begrijpen de initiatie, progressie en regressie van inflammatoire leverziekte bieden. Daarom werd een zeer gevoelige en betrouwbare methode vastgesteld migratie en cel-cel-interacties van andere immuuncellen in muizenlever gedurende lange perioden (ongeveer 6 uur) door intravitale twee-foton laser scanning microscopie (TPLSM) studie in combinatie met intensive care monitoring.
ent "> Werkwijze ontvangen omvat een zachte preparaat en stabiele fixatie van de lever met minimale verstoring van het orgaan en lange termijn intravitale beeldvorming met multicolor multifoton microscopie met vrijwel geen fotobleken en fototoxische effecten gedurende een periode van maximaal 6 uur, waardoor volgen van specifieke leukocyten subsets en stabiele beeldvorming omstandigheden te wijten aan een uitgebreide controle van de muis vitale parameters en stabilisatie van het verkeer, de temperatuur en de gasuitwisseling.Om lymfocytenmigratie op leverontsteking onderzoeken CXCR6.gfp knock-in muizen werden onderworpen aan intravitale leverbeeldvorming onder basisomstandigheden en na acute en chronische leverschade geïnduceerd door intraperitoneale injectie (s) van koolstoftetrachloride (CCl4).
CXCR6 is een chemokine receptor expressie op lymfocyten, voornamelijk Killer Natural T (NKT) -, Natural Killer (NK) – en subsets van T-lymfocyten zoals CD4 T-cellen maar ook mucosale Associated invariante (MAIT) T-cellen 1. Naar aanleiding van de trekkende patroon en de positionering van CXCR6.gfp + immuuncellen toegestaan een gedetailleerd inzicht in hun veranderde gedrag op leverschade en dus hun mogelijke betrokkenheid bij progressie van de ziekte.
Introduction
De visualisatie van cellen en cellulaire functies geheel organen of zelfs hele organismen is van groot belang voor meer dan 50 jaar, waaronder vrijwel alle delen van het lichaam 2. Daarom zijn sommige vroege studies reeds in dienst intravitale beeldvorming van de lever 3,4. Echter, een aantal beperkingen bestaan op de hoogte over de lange termijn een stabiele hoge-resolutie beeldvorming van leverweefsel.
Door de anatomische positie van de lever in nauw contact met het membraan en het maagdarmkanaal 5, het meest voorkomende probleem voor microscopische beeldvorming intravitale beweging door ademhaling en, in mindere mate, peristaltische van het darmkanaal 6. In vergelijking met andere vaste organen, lever chirurgie is een bijzondere uitdaging. Vanwege de dichte microvasculaire structuur, kan chirurgische manipulatie leiden tot massale hemorragische laesies, verminderde microcirculatie 7 en ook de activering van de ingezeten immune cellen zoals Kupffercellen 8. Daarom mechanische fixatie van het weefsel zoals elders gepubliceerd 6,9 waarschijnlijk interfereren met het opklaren beeldvorming.
In een gezonde lever, 10-15% van het totale bloedvolume bevindt in de lever vaatstelsel en het orgaan ontvangt ongeveer 25% van de totale hartminuutvolume 10, waardoor het orgaan zeer gevoelig voor veranderingen in de bloedsomloop (bijv bloeddrukschommelingen ). Daarom zal storingen in de doorbloeding van de lever als gevolg van bv, shear stress, verplaatsing, verwondingen door overmatige weefsel behandeling of gecentraliseerde circulatie leiden tot kunstmatige veranderingen in leukocyten trekgedrag, verminderde lever- zuurstofvoorziening en daarom verdere beschadiging van de lever, waardoor de lever immuunreacties alsook als orgaanpreservatie en totale levensduur van het dier.
Vroege microscopisch werden gebaseerd op intravitale epifluorescentie microscopy, maar een aantal technische beperkingen, zoals foto bleken en indringdiepte laag beperk het gebruik van deze techniek voor de lange termijn lever beeldvorming 4,11,12. Met de ontwikkeling van multifoton microscopie in de jaren 1990 werden de beperkingen van foto bleken of indringdiepte hoofdzakelijk opgelost omdat deze nieuwe methode technisch staat om imaging studies uitgevoerd in vrijwel alle organen in reële situaties 13-15. De belangrijkste resterende problemen inzake leverbeeldvorming waren: ademhaling bewegingen, autofluorescentie van leverweefsel, vastzetten ongewijzigd bloedstroom in de lever sinusoïden, en vooral stabiele beeldvorming voor langere perioden van enkele hr 16.
Hoewel verschillende studies ingegaan op de functie en de migratie van diverse leukocyten in de lever 17, bijvoorbeeld, NKT-cellen 18-20, T-cellen 21,22, lever macrofagen 23,24 of neutrofielen 25, op lange termijn multifoton microscopy imaging nog niet tot stand is gebracht, een taak nog moeilijker bij dieren met acute of chronische leverziekte door de bestaande schade en derhalve hogere gevoeligheid voor verdere schade 26. Echter, monitoring trekgedrag en cellulaire functie van leukocyten in de lever in real time mogelijk maakt nieuwe inzichten in hun specifieke rol in de lever homeostase en ziekte 27.
De chemokine receptor CXCR6 wordt uitgedrukt op verschillende lymfocyten en natuurlijke killer (NK) cellen, NKT-cellen en een aantal T-celpopulaties 18,28. Voorafgaande studies bij muizen hebben aangetoond dat CXCR6 en zijn verwante ligand CXCL16 het patrouilleren van NKT cellen kunnen controleren op de lever sinusoïden tijdens homeostase. Bijgevolg heeft het gebruik van CXCR6.gfp muizen (die een knock-in groen fluorescerend eiwit [gfp] in de CXCR6 locus) beschreven de migratie van lymfocyten onderzocht in diverse organen zoals hersenen 29alsmede lever 18,20, met verhoogde infiltratie van CXCR6.gfp cellen na ontsteking.
Met de in deze studie methode was het mogelijk deze processen gedurende een lange periode onder stabiele omstandigheden te volgen. De intravitale multifoton gebaseerde procedure toegestaan beeldvorming die zeer reproduceerbaar met minimale verstoring van het dier en het orgel was; geoptimaliseerd voor de lange termijn dier overleven door een uitgebreide controle, gevolgd door een nauwgezette controle van de ademhaling en de bloedsomloop; en zeer flexibel en gemakkelijk te nemen ook andere parenchymale organen zoals nieren en milt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het doel van onze studie was een zeer gestandaardiseerde, stabiele en reproduceerbare werkwijze voor intravitale TPLSM beeldvorming van de lever ontwikkelen. Intravitale beeldvorming in het algemeen heeft waardevolle inzichten in cellulaire gedrag onder real life omstandigheden volgende homing en interactie van verschillende leukocyten bevolkingsgroepen in ontwikkeling, homeostase en ziekte gegeven. De bosweg anatomische positie van de lever, waardoor respiratoire en intestinale peristaltische beweging direct worden doo…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank the Central Animal facility of the University Hospital Aachen for technical support. This work was supported by the German Research Foundation (DFG Ta434/2-1, DFG SFB/TRR 57) and by the Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Aachen. This work was further supported by the Core Facility ”Two-Photon Imaging”, a Core Facility of the Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Aachen within the Faculty of Medicine at RWTH Aachen University.
Materials
| Anesthetics | |||
| Buprenorphine | Essex Pharma | 997.00.00 | Analgeticum, 0.1 mg/kg |
| Fentanyl | Rotex Medica | charge: 30819 | |
| Fluovac anesthesia system | Harvard Apparatus | 34-1030 | |
| Glucose 5% | Braun | ||
| ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser | Eickemeyer | 4802885 | |
| Isoflurane | Forene Abbott | B 506 | |
| Isotonic (0.9%) NaCl solution | DeltaSelect GmbH | PZN 00765145 | |
| Ketamin 10% | ceva | Charge: 36217/09 | |
| Xylazin 2% | medistar | Charge: 04-03-9338/23 | |
| Consumable supplies | |||
| 20ml Syringe | BD Plastipak | ||
| 250ml Erlenmeyer flask | Schott Duran | 21 226 36 | |
| 25mL Beaker 2x | Schott Duran | 50-1150 | |
| 2ml syringe | BD Plastipak | ||
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | V7980 | |
| Agarose | commercially available | ||
| Bepanthen Eye and Nose ointment | Bayer Vital GmbH | 6029009.00.00 | |
| Change-A-Tip Deluxe High-Temp Cautery Kit | Fine Science Tools Inc. | 18010-00 | |
| Cotton Gauze swabs | Fuhrmann GmbH | 32014 | |
| Cover Slip 24x50mm | ROTH | 1871 | |
| Durapore silk tape | 3M | 1538-1 | |
| Feather disposable scalpel | Feather | 02.001.30.011 | |
| Fine Bore Polythene Tubing 0,58mm ID | Smiths medical | 800/100/200 | |
| Histoacryl | Braun | 1050052 | 5x 0,5ml |
| Leukoplast | BSN Medical Inc. | ||
| Microscope Slides | ROTH | 1879 | |
| Poly-Alcohol Haut…farblos Antisepticum | Antiseptica GmbH | 72PAH200 | |
| Sterican needle 18 G x 1 | B. Braun | 304622 | |
| Sterican needle 27 3/4 G x 1 | B. Braun | 4657705 | |
| Tissue paper | commercially available | ||
| Surgical Instruments | |||
| Amalgam burnisher 3PL | Gatz | 0110? | |
| Blair retractors (4 pronged (blunt)) x2 | Storz&Klein | S-01134 | |
| Dumont No.7 forceps | Fine Science Tools Inc. | 91197-00 | |
| Graefe forceps curved x1 | Fine Science Tools Inc. | 11151-10 | |
| Graefe forceps straight x2 | Fine Science Tools Inc. | 11050-10 | |
| Heidemann spatula HD2 | Stoma | 2030.00 | |
| Needle holder Mathieu | Fine Science Tools Inc. | 12010-14 | |
| Scissor | Fine Science Tools Inc. | 14074-11 | |
| Semken forceps | Fine Science Tools Inc. | 11008-13 | |
| Small surgical scissors curved | Fine Science Tools Inc. | 14029-10 | |
| Small surgical scissors straight | Fine Science Tools Inc. | 14028-10 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools Inc. | 11000-12 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools Inc. | 15000-08 | |
| Equipment | |||
| ECG Trigger Unit | Rapid Biomedical | 3000003686 | |
| MICROCAPSTAR End-Tidal Carbon Dioxide Analyzer | AD Instruments | ||
| Minivent Typ 845 | Harvard Apparatus | 73-0043 | |
| Multiphoton microscope Trimscope I | LaVision | ||
| Perfusor Compact | B. Braun | ||
| PowerLab 8/30 8 channel recorder | AD Instruments | PL3508 | |
| Temperature controlled heating pad | Sygonix | 26857617 | |
| Temperature sensor | comercially available | ||
| Temperature controlled System for Microscopes -Cube&Box | Life Imaging Services |
Referenzen
- Dusseaux, M., et al. Human MAIT cells are xenobiotic-resistant, tissue-targeted, CD161hi IL-17-secreting T cells. Blood. 117 (4), 1250-1259 (2011).
- Reese, A. J. The effect of hypoxia on liver secretion studied by intravital fluorescence microscopy. Br J Exp Pathol. 41, 527-535 (1960).
- Bhathal, P. S., Christie, G. S. Intravital fluorescence microscopy study of bile ductule proliferation in guinea pigs. Gut. 10 (11), 955 (1969).
- Stefenelli, N. Terminal vascular system and microcirculation of the rat liver in intravital microscopy. Wien Klin Wochenschr. 82 (33), 575-578 (1970).
- Hori, T., et al. Simple and sure methodology for massive hepatectomy in the mouse. Ann Gastroenterol. 24 (4), 307-318 (2011).
- Tanaka, K., et al. Intravital dual-colored visualization of colorectal liver metastasis in living mice using two photon laser scanning microscopy. Microsc Res Tech. 75 (3), 307-315 (2011).
- Schemmer, P., Bunzendahl, H., Klar, E., Thurman, R. G. Reperfusion injury is dramatically increased by gentle liver manipulation during harvest. Transpl Int. 13, S525-S527 (2000).
- Schemmer, P., et al. Activated Kupffer cells cause a hypermetabolic state after gentle in situ manipulation of liver in rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 280 (6), G1076-G1082 (2001).
- Toiyama, Y., et al. Intravital imaging of DSS-induced cecal mucosal damage in GFP-transgenic mice using two-photon microscopy. J Gastroenterol. 45 (5), 544-553 (2010).
- Zimmon, D. S. The hepatic vasculature and its response to hepatic injury: a working hypothesis. Yale J Biol Med. 50 (5), 497-506 (1977).
- Wong, J., et al. A minimal role for selectins in the recruitment of leukocytes into the inflamed liver microvasculature. J Clin Invest. 99 (11), 2782-2790 (1997).
- Bonder, C. S., et al. Essential role for neutrophil recruitment to the liver in concanavalin A-induced hepatitis. J Immunol. 172 (1), 45-53 (2004).
- Xu, C., Zipfel, W., Shear, J. B., Williams, R. M., Webb, W. W. Multiphoton fluorescence excitation: new spectral windows for biological nonlinear microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (20), 10763-10768 (1996).
- Centonze, V. E., White, J. G. Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging. Biophys J. 75 (4), 2015-2024 (1998).
- Amore, J. D., et al. In vivo multiphoton imaging of a transgenic mouse model of Alzheimer disease reveals marked thioflavine-S-associated alterations in neurite trajectories. J Neuropathol Exp Neurol. 62 (2), 137-145 (2003).
- Hickey, M. J., Westhorpe, C. L. V. Imaging inflammatory leukocyte recruitment in kidney, lung and liver–challenges to the multi-step paradigm. Immunol Cell Biol. 91 (4), 281-289 (2013).
- McLellan, M. E., Kajdasz, S. T., Hyman, B. T., Bacskai, B. J. In vivo imaging of reactive oxygen species specifically associated with thioflavine S-positive amyloid plaques by multiphoton microscopy. J Neurosci. 23 (6), 2212-2217 (2003).
- Geissmann, F., et al. Intravascular Immune Surveillance by CXCR6+ NKT Cells Patrolling Liver Sinusoids. PLoS Biology. 3 (4), (2005).
- Velázquez, P., et al. Cutting edge: activation by innate cytokines or microbial antigens can cause arrest of natural killer T cell patrolling of liver sinusoids. J Immunol. 180 (4), 2024-2028 (2008).
- Wehr, A., et al. Chemokine receptor CXCR6-dependent hepatic NK T Cell accumulation promotes inflammation and liver fibrosis. J Immunol. 190 (10), 5226-5236 (2013).
- Khandoga, A., Hanschen, M., Kessler, J. S., Krombach, F. CD4+ T cells contribute to postischemic liver injury in mice by interacting with sinusoidal endothelium and platelets. Hepatology. 43 (2), 306-315 (2006).
- Egen, J. G., et al. Macrophage and T cell dynamics during the development and disintegration of mycobacterial granulomas. Immunity. 28 (2), 271-284 (2008).
- Beattie, L., et al. Leishmania donovani-induced expression of signal regulatory protein alpha on Kupffer cells enhances hepatic invariant NKT-cell activation. Eur J Immunol. 40 (1), 117-123 (2010).
- Beattie, L., et al. Dynamic imaging of experimental Leishmania donovani-induced hepatic granulomas detects Kupffer cell-restricted antigen presentation to antigen-specific CD8 T cells. PLoS Pathog. 6 (3), e1000805 (2010).
- McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330 (6002), 362-366 (2010).
- Vanheule, E., et al. An intravital microscopic study of the hepatic microcirculation in cirrhotic mice models: relationship between fibrosis and angiogenesis. Int J Exp Pathol. 89 (6), 419-432 (2008).
- Jenne, C. N., Kubes, P. Immune surveillance by the liver. Nat Immunol. 14 (10), 996-1006 (2013).
- Zimmermann, H. W., Tacke, F. Modification of chemokine pathways and immune cell infiltration as a novel therapeutic approach in liver inflammation and fibrosis. Inflamm Allergy Drug Targets. 10 (6), 509-536 (2011).
- Kim, J. V., et al. Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites. J Immunol Methods. 352 (1-2), 89-100 (2010).
- Karlmark, K. R., et al. Hepatic recruitment of the inflammatory Gr1+ monocyte subset upon liver injury promotes hepatic fibrosis. Hepatology. 50 (1), 261-274 (2009).
- Heymann, F., et al. Hepatic macrophage migration and differentiation critical for liver fibrosis is mediated by the chemokine receptor C-C motif chemokine receptor 8 in mice. Hepatology. 55 (3), 898-909 (2012).
- Ramachandran, P., et al. Differential Ly-6C expression identifies the recruited macrophage phenotype, which orchestrates the regression of murine liver fibrosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (46), E3186-E3195 (2012).
- Moles, A., et al. A TLR2/S100A9/CXCL-2 signaling network is necessary for neutrophil recruitment in acute and chronic liver injury in the mouse. J Hepatol. 60 (4), 782-791 (2014).
- Hammerich, L., et al. Chemokine receptor CCR6-dependent accumulation of γδ T cells in injured liver restricts hepatic inflammation and fibrosis. Hepatology. 59 (2), 630-642 (2014).
- Syn, W. -. K., et al. NKT-associated hedgehog and osteopontin drive fibrogenesis in non-alcoholic fatty liver disease. Gut. 61 (9), 1323-1329 (2012).
- McDonald, B., et al. Interaction of CD44 and hyaluronan is the dominant mechanism for neutrophil sequestration in inflamed liver sinusoids. J Exp Med. 205 (4), 915-927 (2008).
- Egen, J. G., et al. Intravital imaging reveals limited antigen presentation and T cell effector function in mycobacterial granulomas. Immunity. 34 (5), 807-819 (2011).
- Singer, G., Stokes, K. Y., Granger, D. N. Hepatic microcirculation in murine sepsis: role of lymphocytes. Pediatr Surg Int. 24 (1), 13-20 (2008).
- Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nat Med. 17 (11), 1381-1390 (2011).
- Khandoga, A. G., et al. In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue. PLoS One. 4 (3), e4693 (2009).
