Summary

Immunohistochimie et d'étiquetage multiple avec des anticorps de l'espèce hôte mêmes pour l'étude des adultes hippocampe neurogenèse

Published: April 22, 2015
doi:

Summary

This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.

Abstract

Neurogenèse adulte est un processus très réglementé multi-étape dans laquelle de nouveaux neurones sont générés à partir d'une cellule souche neurale activé par de plus en plus engagés sous-types de souches intermédiaires. Chacun de ces sous-types exprime un ensemble de marqueurs moléculaires spécifiques qui, avec des critères morphologiques spécifiques, peuvent être utilisés pour leur identification. Typiquement, les techniques d'immunofluorescence sont appliqués impliquant des anticorps spécifiques du sous-type en combinaison avec des marqueurs de prolifération exo ou endogènes. Nous décrivons ici immunomarquage méthodes pour la détection et la quantification de tous les stades de la neurogenèse hippocampique adulte. Celles-ci comprennent l'application d'analogues de la thymidine, perfusion transcardial, traitement des tissus, épitope par la chaleur, ABC immunohistochimie, immunofluorescence indirecte multiple, microscopie confocale et de quantification des cellules. En outre, nous présentons un protocole d'immunofluorescence multiple séquentielle qui contourne les problèmes usually découlant de la nécessité d'utiliser des anticorps primaires soulevées dans les mêmes espèces hôtes. Il permet une identification précise de tous les sous-types de souches de l'hippocampe avec un marqueur de prolifération dans une seule section. Ces techniques sont un outil puissant pour étudier la régulation de différents sous-types de souches en parallèle, leur implication dans les pathologies du cerveau et de leur rôle dans les fonctions spécifiques du cerveau.

Introduction

Deux régions du cerveau de manière constitutive générer de nouveaux neurones tout au long de la vie, la zone sous-ventriculaire des ventricules latéraux et la zone sous-granulaire (SGZ) du gyrus denté de l'hippocampe (DG). Les nouveaux neurones dérivent de cellules progénitrices neurales et passent par différents stades de développement morphologique et physiologique avant d'atteindre la maturité 1,2. A partir d'une cellule souche radiale divisant lentement glie-like (type 1) étages consécutifs de transit amplification de cellules progénitrices intermédiaires se présentent. Les sous-types plus indifférenciées (type 2a et 2b) de type ont une forme irrégulière avec de courtes, les processus tangentielles. Ils génèrent des neuroblastes (type 3) qui sortent graduellement du cycle cellulaire pour devenir neurones immatures (avec dendrites étendus vers la couche moléculaire) et finalement se intégrer dans le réseau de l'hippocampe des cellules granulaires comme matures. En raison de leurs caractéristiques physiologiques particulières ces cellules fournissent les circuits améliorés avec la plasticité 3 suggesTing un rôle unique dans la fonction hippocampique. En fait, les études de la dernière décennie ont généré des preuves substantielles que la neurogenèse adulte contribue à la mémoire spatiale, la séparation de modèle et le comportement émotionnel 4,5.

Neurogenèse adulte peut être étudiée en utilisant des approches différentes. analogues de la thymidine intègrent dans l'ADN au cours de la phase S du cycle cellulaire et permettent la naissance datant, la quantification et le destin analyse des cellules nés 6-8. L'application séquentielle des différents analogues de la thymidine (par exemple, CldU, EdU ou UDI) peut être utilisée pour étudier le renouvellement cellulaire ou populations de cellules nés à différents moments au cours d'une expérience 9. Une alternative, le marqueur endogène pour la prolifération cellulaire est Ki67. Il est exprimé dans les cellules en division au cours de toutes les phases du cycle cellulaire (G1, S, G2, M) à l'exception de la phase de repos (G0) et le début de G1 10,11. Afin d'analyser le phénotype des populations de cellules-nés chez l'adulte dentate gyrus plusieurs marqueurs moléculaires spécifiques de stade peuvent être utilisés tels que GFAP, nestine, DCX et NeuN 1,6. GFAP est un marqueur des astrocytes matures, mais est également exprimé dans les cellules gliales radiales comme dans le cerveau antérieur des adultes. Nestin est un filament intermédiaire spécifique des cellules gliales radiales ressemblant et les cellules progénitrices intermédiaires début. DCX est une protéine associée aux microtubules exprimée dans les progéniteurs intermédiaires, les neuroblastes et les neurones immatures. Basé sur le (co) expression de ces trois marqueurs et les caractéristiques morphologiques des cellules marquées quatre sous-types de cellules souches distinctes peuvent être identifiés: le type 1 (GFAP +, nestine +, DCX -), le type 2a (GFAP -, nestine + , DCX -), le type 2b (GFAP -, nestine +, DCX +) et le type 3 (GFAP -, nestine -, DCX +) 1. Co-marquage de DCX avec NeuN, qui est exprimé dans les neurones post-mitotiques, permet la différenciation des immature (DCX +, NeuN +) et matures (DCX -, NeuN +) neurones granulaires.

Les marqueurs mentionnés ci-dessus sont fréquemment utilisés pour co-marquage immunofluorescent et microscopie confocale ultérieur pour analyser le nombre et l'identité des cellules de nouveau-nés. Cela nécessite habituellement des anticorps de différentes espèces hôtes anticorps pour empêcher une réactivité croisée indésirable. Cependant, la majorité des anticorps primaires appropriés pour la recherche de la neurogenèse sont élevés soit chez le lapin ou souris (par exemple, souris α-BrdU, souris α-NeuN, lapin α-Ki67, lapin α-GFAP). Cela conduit à de sérieuses limitations dans le nombre et la combinaison des antigènes qui peuvent être évalués en une seule tranche. Ceci à son tour augmente non seulement l'effort de coloration, selon colorations multiples doivent être effectuées, mais peut aussi compromettre la fiabilité des résultats. De plus, certains antigènes sont sensibles à la formaline épitope induite par masquage de fixation (par exemple, Ki67, La nestine). Nous décrivons ici modifications des protocoles de immunomarquage simples et multiples classiques (par exemple, la récupération de l'épitope, immunocoloration séquentielle multiples, utilisation de la nestine-GFP souris transgéniques 12) à surmonter bon nombre de ces questions. En particulier, le protocole d'immunofluorescence multiple séquentielle permet coloration contre un maximum de quatre antigènes différents même si une partie des anticorps est dérivé du même hôte. Ceci permet la détection simultanée de type 1, type 2a, 2b et le type des cellules progénitrices de type 3, ainsi que leur activité proliferative dans une seule section.

Protocol

NOTE: Toutes les procédures impliquant des animaux vivants ont été effectuées conformément à la directive CE 86/609 / CEE des lignes directrices sur le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et approuvé par le comité d'éthique local (Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz). 1. Injection par voie intrapéritonéale analogues de la thymidine Peser les animaux le jour avant l'injection. Calculez le montant de la thymidine…

Representative Results

Nous avons appliqué les méthodes décrites ci-dessus pour quantifier et caractériser les cellules de nouveau-nés dans les postnatales et adultes hippocampe. Par conséquent, nous avons utilisé de type sauvage et la neurogenèse déficientes cycline D2 knock out (KO) Ccnd2 souris logées dans des conditions connues pour affecter le taux de la neurogenèse (ie, l'environnement enrichi, EE) 13,14. DAB coloration immunohistochimique soit contre Ki67, BrdU, CldU ou IdU toujours révélé…

Discussion

Quantification et identification des sous-populations de cellules nouveau-nés est une question centrale dans la recherche de la neurogenèse adulte. Combinant marqueurs de prolifération et des anticorps contre les protéines exprimées au cours des étapes spécifiques de la neurogenèse adulte permet la détection immunohistochimique de ces sous-populations. Certains des anticorps ou des combinaisons d'anticorps de coloration nécessitent des conditions particulières.

Étiquetage des…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors thank S. Tausch for excellent technical assistance. The work was supported by BMBF (Bernstein Focus 01GQ0923) and DFG (FOR1738).

Materials

Name Company Catalog Number Comments & Dilutions
Thymidine analog administration
5-Bromo-2′-deoxyuridine, BrdU Sigma-Aldrich B9285 toxic (mutagenic, teratogenic)
5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU Sigma-Aldrich C6891
5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU MP Biomedicals 2105478
5-Iodo-2′-deoxyuridine, IdU MP Biomedicals 2100357
Tissue preparation
Isoflurane-Actavis Piramal Healthcare 700211
Paraformaldehyde powder (PFA) Riedel-De Häen 16005 toxic, flammable
Perfusion pump PD5206 Heidolph Instruments 523-52060-00
Masterflex Tygon lab tubing, Ø 0.8 mm  Thermo Fischer Scientific 06409-13
Feeding needle, straight, 21G, 1.75mm olive tip, 40mm Agnthos 1036
Freezing microtome Microm HM 400 Thermo Fischer Scientific
24 Well Cell Culture Multiwell Plates Greiner Bio-One 662160
Immunohistochemistry
Tefal Vitacuisine Steamer Tefal VS 4001
Netwell 24mm Polyester Mesh Membrane Inserts Pre-Loaded in 6-Well Culture Plates Corning 3479
Netwell 15mm Polyester Mesh Membrane Inserts Pre-Loaded in 12-Well Culture Plates Corning 3477
Netwell Plastic 6-Well Carrier Kit for 24mm Polyester Mesh Membrane Inserts Corning 3521
Netwell Plastic 12-Well Carrier Kit for 15mm Polyester Mesh Membrane Inserts Corning 3520
Vectastain Elite ABC Kit Vector Laboratories PK-6100
DAB (3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate) Sigma-Aldrich D-5637 carcinogenic, light sensitive
Fluoromount-G SouthernBiotech 0100-01
Primary antibodies
rabbit IgG1 α-Ki67 Novocastra/ Leica Biosystems NCL-L-Ki67MM1 DAB 1:400/IF 1:100; requires epitope retrieval
rabbit α-GFAP, AS-3-GF Synaptic Systems 173 002 1:500
goat IgG (H+L) α-GFP Acris Antibodies R1091P 1:300
mouse IgG1 α-nestin Abcam ab6142 1:200; requires epitope retrieval
guinea pig IgG (H+L) α-Doublecortin Merck Millipore AB2253 1:500
rat IgG2a α-BrdU (ascites) AbD Serotec/ Bio-Rad OBT0030CX for detection of BrdU; DAB 1:500/IF 1:400
rat IgG2a α-BrdU (purified) AbD Serotec/ Bio-Rad OBT0030   for detection of CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400
mouse IgG1ĸ α-BrdU BD Biosciences 347580 for detection of IdU; DAB 1:500/IF 1:350
mouse IgG1 α-NeuN Merck Millipore MAB377 1:500
Secondary antibodies
donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Biotin Dianova 711-065-152 1:500
donkey α-rat IgG (H+L)-Biotin Dianova 712-065-150 1:500
donkey α-mouse IgG (H+L)-Biotin Dianova 715-065-151 1:500
goat α-rat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 Molecular Probes A11006 1:250
donkey α-goat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 Molecular Probes A11055 1:250
donkey α-mouse IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment Dianova 715-097-003 1:100
donkey α-mouse IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 Dianova 715-605-151 1:250
donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 Dianova 706-605-148 1:250
donkey α-rat IgG (H+L)-Rhodamine Red-X Dianova 712-295-150 1:250
donkey α-rabbit IgG (H+L)-Rhodamine Red-X Dianova 711-295-152 1:250
donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Rhodamine Red-X Dianova 706-296-148 1:250
Streptavidin-Rhodamine Red-X  Dianova 016-290-084 1:500
goat α-rabbit IgG (H+L)-AMCA Dianova 111-155-144 1:250, works only with rabbit α-GFAP
Hoechst 33342 Molecular Probes H3570 1:1000
DAPI Molecular Probes D1306 1:1000
Blocking
Fab-fragment donkey α-mouse IgG (H+L) Dianova 715-007-003 1:20
Fab-fragment donkey α-rabbit IgG (H+L) Dianova 711-007-003 1:20
Normal donkey serum Merck Millipore S30
Normal rabbit serum Dianova 011-000-010
Normal goat serum Dianova 005-000-001
Bovine Serum Albumine Sigma-Aldrich A7906
Histology
Cresyl violett Sigma-Aldrich C5042
Neo-Clear Merck Millipore 109843 non-toxic xylene substitute
Neo-Mount Merck Millipore 109016 permanent mounting medium
Microscopy
Axioskop 2 Carl Zeiss Microscopy
LSM 710 Carl Zeiss Microscopy

Referenzen

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Diesen Artikel zitieren
Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis. J. Vis. Exp. (98), e52551, doi:10.3791/52551 (2015).

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