Summary

Investigando Mastócito Secretory grânulos; de Biossíntese de Exocytosis

Published: January 26, 2015
doi:

Summary

O objectivo do presente protocolo foi o de desenvolver um método que permita análises genómicas funcionais da secreção de mastócitos. O protocolo baseia-se na avaliação quantitativa da libertação de um gene repórter fluorescente cotrasfected com o gene de interesse e análises em tempo real da morfologia do grânulo secretor.

Abstract

Mastócitos (MC) são células secretoras do sistema imunitário que realizam as suas funções fisiológicas e patológicas através da libertação de mediadores alérgicos, inflamatórios e imuno pré-formada e recém-sintetizadas. Mediadores MCs 'afetar vários tecidos e órgãos, culminando em respostas alérgicas e imunológicas. A síntese, armazenamento e liberação dos mediadores MC são altamente regulamentados. Os mediadores pré-formados são embalados em grânulos secretores citoplasmáticos (SG) que se fundem com a membrana plasmática e libertam o seu conteúdo por exocitose regulada. Apresenta-se um protocolo, com base na co-expressão de um gene de interesse com um gene repórter que está voltado para as SG e é libertada de um modo regulado com os mediadores de SG endógenos. O protocolo permite alta resolução quatro confocal dimensional análises do MC GV e monitorização da sua linha do tempo a partir de biogênese a exocitose disparada. Assim, usando esse protocolo para a triagem de genes entreest por sua fenotípica e funcional impacto permite decifrar os mecanismos moleculares que governam a biogênese e exocitose do MC GV e identificar os reguladores envolvidos. Assim, devem ser fornecidos mais insights sobre os mecanismos celulares que respondem por função MCs na saúde e na doença.

Introduction

Mastócitos (MC) são células imunes que são melhor conhecidas pelo seu envolvimento em reacções alérgicas e inflamatórias tais como artrite, asma, esofagite eosinofílica, dermatite crónica e choque anafilático 1,2 bem como outras patologias, incluindo doença da artéria coronária e 3,5 cancro 3,4. Além disso, MCs desempenham importantes papéis na imunidade inata e adaptativa, tanto na defesa do hospedeiro contra as bactérias e os parasitas e por supressão de respostas imunológicas, por exemplo, induzir tolerância do enxerto 5,6.

MCs originam a partir da medula óssea, o desenvolvimento de células CD34 + / CD117 + células progenitoras pluripotentes 7. Medula óssea Committed progenitores MC são liberados na corrente sanguínea e migram para os tecidos periféricos que localizam predominantemente no interior de tecidos conjuntivos e superfícies epiteliais 8. Maturação e diferenciação terminal, eventualmente, são alcançados sob a influência of citocinas no meio circundante 8,9.

MCs pode ser activado por um alergénio (antigénio, Ag), cujo encontro resultou na geração de imunoglobulina E (IgE) digite anticorpos. A ligação de IgE a receptores de tais FceRI do MC, seguido por ligação cruzada de IgE ligada à célula após re-exposição ao mesmo Ag, resulta em agregação FceRI e iniciação de uma cascata de sinalização que culmina na desgranulação celular [revisto em 10,11] . MCs também são ativadas, independentemente de IgE, por neuropeptídeos 5,12, toxinas 13, bacteriana e antígenos virais 14,15, uma série de peptídeos carregados positivamente colectivamente referidos como secretagogues básicos, células do sistema imunológico e citocinas 5,13,12,16 , 17. MCs também são activadas por muitos dos seus próprios mediadores libertados, que desenvolvem ainda mais a resposta inflamatória.

MCs são embalados com grânulos de secreção (SGs) que contêm imunomediadores reguladoras, incluindo aminas vasoactivas, tais como histamina e serotonina (em roedores), proteoglicanos, proteases, tais como triptase e quimase, factor de crescimento endotelial vascular e várias citocinas e quimiocinas 8,9. Estes mediadores são "pronto para ir" e uma vez MCs são ativados por um estímulo adequado, esses mediadores são liberados das células por exocitose regulada (desgranulação) em questão de segundos a minutos 18,19. Este evento inicial é seguido pela síntese de novo e libertação de uma grande variedade de substâncias biologicamente potentes, incluindo metabolitos de ácido araquidónico, várias citocinas e quimiocinas 20,21,22. Lançamento de produtos recém-sintetizados ocorre independentemente da liberação SG. Coletivamente, esses mediadores iniciar precoces e fase tardia respostas inflamatórias e alérgicas. Portanto, a compreensão dos mecanismos responsáveis ​​por ativação MC e degranulação são ambos de imp teórico e clínicoortance.

A dificuldade de manipular geneticamente MCs primárias e cultivadas tem dificultado as tentativas para elucidar os mecanismos subjacentes MC degranulação, que continuou mal resolvidos. Para superar este problema foi desenvolvido um ensaio baseado repórter por co-transfecção da linha de células da mucosa do mastro, leucemia basofílica de rato (RBL) -2H3 (aqui referidos como RBL) ou da medula óssea derivadas MCs (BMMCs) 30 com um gene de interesse e O neuropeptídeo Y (NPY) fundido a RFP monomérica (MRFP), como um repórter SG.

NPY foi anteriormente mostrado para recapitular o comportamento dos marcadores SG endógenos em outros sistemas. Além disso, porque MRFP fluorescência é insensível pH, a expressão do NPY-MRFP permite a visualização dos GV de ácidos, bem como a avaliação quantitativa de exocitose, utilizando placas de 96 poços e um leitor de placas de fluorescência. Mostrámos que o NPY-MRFP é entregue aos SGs ácidas de células RBL e BMMCs e é libertado a partir das célulasde uma forma regulada juntamente com a carga SG endógenos (isto é, β-hexosaminidase e serotonina) 30, 32. Este protocolo prevê uma metodologia baseada em imagens de alta resolução que permite que genes de triagem de interesse para a sua fenotípica e funcional impacto sobre as características de SG e desgranulação em células RBL 32. Especificamente, este protocolo permite o acompanhamento em tempo real do MC SG e quantificação da sua área ou tamanho do volume, o seu número, a cinética de montagem, o seu movimento ao longo do citoesqueleto da célula e a sua fusão definitiva com a membrana do plasma sob diferentes condições. Por exemplo, sensibilizar as células com DNP-IgE específica e desencadear as células com um Ag multivalente (DNP conjugado a albumina do soro) sob diferentes perturbações (isto é, o knockdown de genes de interesse, sobre a expressão de genes wt ou mutantes, ou manipulações farmacológicas) e comparação com células de controlo.

Protocol

1. Preparação de células RBL Meios de Cultura Misturar 500 ml de meio de Eagle modificado de baixo teor de glucose de Dulbecco (DMEM) com 56 ml de soro fetal bovino (esta faz com que 10% de FBS), e, em seguida, adicionar 5,5 ml de penicilina estreptomicina (isto faz ~ 1% PEST). Filtrar a mídia usando 500-1.000 ml Bottle-Top Filtros de vácuo com 0,22 tamanho dos poros e armazenar a 4 ° C. 2. Cultura de Células RBL Cultivar células RBL em uma atmos…

Representative Results

Devido à baixa eficiência de transfecção de MCs, as manipulações genéticas são susceptíveis de deixar um impacto sobre as leituras de secreção média medidos por mediadores endógenos SGs. No entanto, mediante o estabelecimento de co-expressão completa do gene repórter NPY-MRFP e o plasmídeo de co-transfectados nas mesmas células, a monitorização dos resultados NPY-MRFP exclusivamente no controlo da população de células que expressa o gene de interesse. Portanto, a vantagem deste ensaio em comparaç?…

Discussion

Descrevemos uma estratégia inovadora que combina quantificação de MCs exocitose e quatro (x, y, z, t) quantificações de dimensão por imagiologia tridimensional tempo decorrido dos SGs em células vivas, utilizando um gene repórter para a exocitose. Esta técnica permite a triagem das famílias de proteínas para o seu impacto sobre a função MC como SGs de monitoramento a partir tão cedo quanto a sua saída do Golgi através de sua maturação, a aquisição de competências exocitose e degranulação. A combin…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos ao Dr. U. Ashery pelo dom da NPY-MRFP cDNA. Agradecemos Drs. MJ Kofron, L. Mittleman, M. Shaharbani, e Y. Zilberstein para ajuda inestimável com microscopia e análise de imagem. Agradecemos também o Dr. Joseph Orly para a leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado por uma doação da Fundação Israel Ciência, fundada pela Academia de Ciências de Israel (1139/12 a RS-e.).

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
DMEM Sigma-Aldrich D6046-500ML Warm in 37 °C water bath before use
Fetal Bovine Serum GE health care Life sciences SH30071.01
Penicillin-Streptomycin Life technologies
Cellulose acetate membrane, pore size 0.22 μm Sigma-Aldrich CLS430769-1EA
Corning tissue-culture treated culture dishes Sigma-Aldrich CLS430167
Trypsin/EDTA Solution (TE) Life technologies R001100 Warm in 37 °C water bath before use
PIPES dipotassium salt Sigma-Aldrich 108321-27-3 
Calcium acetate hydrate Sigma-Aldrich 114460-21-8
Magnesium acetate tetrahydrate Sigma-Aldrich M5661 
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate (Potassium glutamate) Sigma-Aldrich G1501
4 mm electroporation cuvettes cell projects EP-104
GENE PULSER WITH PULSE CONTROLLER & CAPACITANCE Bio rad
Chambered coverglass Thermo scientific 155411
24 well, flat bottom Sigma-Aldrich CLS3524
Corning 96 well plates Sigma-Aldrich CLS3367 or CLS390
96 well plate fluorescence reader- Infinite 200 Tecan
Calcium ionophore A23187 Sigma-Aldrich C7522 Avoid from direct light exposure
12-O-tetradecanoyl-13-acetate (TPA) Calbiochem P3766
anti-DNP monoclonal IgE Sigma-Aldrich D8406 
DNP-BSA/ DNP-HAS Sigma-Aldrich A6661 Avoid from direct light exposure
Triton-x-100 Sigma-Aldrich T8787
Confocal fluorescent microscope:
Zeiss LSM 510
Leica SP5
Nikon A1 inverted
Imaris software BITLANE
Microsoft exel or Prism or other analyses software
Other reagent:
Magnesium Chloride MERK 5833
Sodium chloride MERK 6404
Calcium chloride  MERK 2382
Bovine serum albumin  Sigma-Aldrich A4503
Glucose BDH Laboratories 284515V
Monosodium phosphate  MERK 5345
Sterile water

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Diesen Artikel zitieren
Azouz, N. P., Fukuda, M., Rothenberg, M. E., Sagi-Eisenberg, R. Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis. J. Vis. Exp. (95), e52505, doi:10.3791/52505 (2015).

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