Embriyone Tavuk Yumurta Grip Virüsü Yayılım
Summary
Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.
Abstract
Grip enfeksiyonu yaklaşık 36.000 ölüm ve Amerika Birleşik Devletleri'nde 200.000 'den fazla hastaneye yatış her yıl ile ilişkilidir. Mutasyon ve yeniden çeşitler nedeniyle yeni influenza virüs türlerinin sürekli ortaya çıkması virüsün kontrol komplike ve yeni ilaçların ve aşıların kalıcı geliştirilmesini gerekli kılmaktadır. Grip laboratuar tabanlı çalışma virüsün yayılması için güvenilir ve maliyet-etkin bir yöntem gerektirir. Burada, bir kapsamlı protokol sürekli olarak yüksek titre virüs stokları elde edilir verimli tavuk yumurta influenza A virüs yayılması için sağlanır. 11 gün – Kısaca, serum patojen içermeyen (SPF) döllenmiş tavuk yumurtası 37 ° C ve 10% 55-60 nemde bekletilir. Bu süre içinde, embriyo gelişimi kolaylıkla bir yumurta Candler kullanılarak izlenebilir. Virüs aşı, bir iğne ile allantoik oyuğuna virüs stokunun püskürtülmesiyle gerçekleştirilir. 37 ° C'de inkübasyon 2 gün sonra yumurta4 ° C'de en az 4 saat süre ile donduruldu. Hava kesesi ve chorioallantoic membran üzerinde yumurta kabuğu sonra dikkatlice açılır, ve virüs içeren allantoik sıvı hasat edilir. sıvı, santrifüj ile etrafı temizlenmiş alikotlandı ve uzun süreli depolama için -80 ° C'ye kadar aktarılır. büyük miktarda, genellikle, bu protokol ile elde edilir ve yüksek virüs titresi (bir virüs içeren yumurta başına sıvının 5-10 mi) büyük miktarlarda ihtiyaç in vitro çalışmalar için, özellikle, virüs preparatı eden uygun bir yöntem için yumurta kullanımını yapmıştır virüs içinde, aynı virüs stokunun yüksek dozlar gereklidir.
Introduction
Grip A insan sağlığı için büyük bir tehdit olmaya devam ediyor. Büyük bir küresel yük dünya çapında yılda 1 500.000 ölüme kadar neden olan bir yıkıcı solunum hastalığıdır. Grip virüsleri ailesi Orthomyxoviridae olup genomları 1,2, 8 negatif sens, tek iplikçikli RNA taşır. Viral genomun yüksek değişebilirlik (yani, antijenik "sürüklenme") uzun vadeli bağışıklık engeller. Ayrıca, grip, anti-viral ilaçlar 3 giderek dayanıklıdır.
2009 H1N1 pandemik influenza hastalığının (pandemik suşu anti-viral direnç, gecikmiş aşı üretimi) ile ilgili tüm zorlu konuları vurgulanır. Aşı formülasyonu büyük olasılıkla patojenik influenza suşları 4 (H1N1, H3N2 ve İnfluenza B için birer adet) için Dünya Sağlık Örgütü tarafından her yıl belirlenir. Bu yöntem tahmin grip suşu dayandığındans, patojen suşları bazen yanlış tespit ve aşı etkinliği önemli ölçüde düşer vardır. Ayrıca, yeni grip suşları görünümü pandemik hastalık 2 neden bu koruyucu programları aşmak olabilir.
evrensel grip aşısının oluşturulması 5 zor olmuştur. Bu nedenle, araştırma akciğer hasarının patogenezinde anlamak içine devam etmelidir. Tesis laboratuar araştırmaları için, çeşitli yöntemler viral izolasyon ve yayılma 6 geliştirilmiştir. İnsan grip virüsleri, memeli hücre çeşitli substratlar olarak amplifiye edilebilir. Bununla birlikte, büyük miktarlarda üretilmesi yüksek titre virüsleri iyi embriyo haline gelmiş yumurtalardan elde edilmektedir. Aşağıdaki protokol grip için mevcut virüs stoklarından bir virüs yayılımını ve depolama tekniğini açıklar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Grip hastalığının büyük bir küresel yük olur, ve iş akciğer hasarı 7 patogenezi anlayış içine devam ediyor. Bu ölümcül hastalık kolaylaştırdı araştırma, çeşitli yöntemler grip virüsü 6 yaymak için geliştirilmiştir. Burada, biz tavuk yumurtası influenza virüsü üretmek için bir tekniği açıklar. Bu yöntemin avantajı, yüksek oranda tekrarlanabilir olduğunu ve çoğu zaman, in vitro çalışmalar için gerekli olan yüksek titre grip virüsü hisse sen…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The present study was supported by the NIH grants HL120947 (P.C.), HL103868 (P.C.), and the American Heart Association Grant-in-Aid (P.C.)
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | |
| serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs | VALO BioMedia | n/a | |
| humidified egg incubator | FARM iNNOVATORS | Model 2100 | |
| automatic egg turner | FARM iNNOVATORS | Model 3200 | |
| egg candler | FARM iNNOVATORS | Model 3300 | |
| 1 ml syringe | BD Bioscience | 309659 | |
| 18G needle | BD Bioscience | 305196 | |
| 20G / 22G needle | BD Bioscience | 305176 / 305156 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Ethanol, >99.5% | Sigma-Aldrich | 459844 | diluted to 70% using water |
| glue gun "Ad tech Hi Temp Project Pro" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | Model 1105 | |
| glue "Ad tech MINI SIZE, Multi Temp" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | 220-34ZIP30 | |
| MDCK cells | ATCC | CRL-2935 | |
| Washed Pooled Turkey Red Blood Cells, 10% | Lampire Biological Laboratories | 724908 |
Referenzen
- Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Estimates of deaths associated with seasonal influenza — United States, 1976-2007. MMWR. Morbidity and mortality weekly report. 59 (33), 1057-1062 (2010).
- Neumann, G., Noda, T., Kawaoka, Y. Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus. Nature. 459 (7249), 931-939 (2009).
- Tumpey, T. M., Garcia-Sastre, A., et al. Pathogenicity of Influenza Viruses with Genes from the 1918 Pandemic Virus: Functional Roles of Alveolar Macrophages and Neutrophils in Limiting Virus Replication and Mortality in Mice. J Virol. 79 (23), 14933-14944 (2005).
- Doherty, P. C., Turner, S. J., Webby, R. G., Thomas, P. G. Influenza and the challenge for immunology. Nat Immu. 7 (5), 449-455 (2006).
- Webster, R. G., Govorkova, E. A. Continuing challenges in influenza. Ann N Y Acad Sci. 1323 (1), 115-139 (2014).
- Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. Unit 15G.1 Influenza: propagation, quantification, and storage. . Current protocols in microbiology. , (2006).
- Short, K. R., Kroeze, E. J. B. V., Fouchier, R. A. M., Kuiken, T. Pathogenesis of influenza-induced acute respiratory distress syndrome. Lancet Infect Dis. 14 (4), 57-69 (2014).
- Ito, T., Suzuki, Y., et al. Differences in sialic acid-galactose linkages in the chicken egg amnion and allantois influence human influenza virus receptor specificity and variant selection. J Virol. 71 (4), 3357-3362 (1997).
- Robertson, J. S., Nicolson, C., Major, D., Robertson, E. W., Wood, J. M. The role of amniotic passage in the egg-adaptation of human influenza virus is revealed by haemagglutinin sequence analyses. J Gen Virol. 74 (Pt 10), 2047-2051 (1993).
- Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells). Appl Microbiol. 16 (4), 588-594 (1968).
