रासायनिक सुरक्षा स्क्रीनिंग और सिस्टम्स बायोलॉजी डेटा पीढ़ी के लिए विकासात्मक विषाक्तता Assays के आधार पर मानव स्टेम सेल
Summary
प्रोटोकॉल मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं और transcriptome अध्ययन के आधार पर दो इन विट्रो विकासात्मक विषाक्तता परीक्षण प्रणाली (UKK और UKN1) का वर्णन है। परीक्षा प्रणाली मानव विकास की विषाक्तता के लिए खतरा भविष्यवाणी है, और जानवरों के अध्ययन, लागत और रासायनिक सुरक्षा के परीक्षण के लिए आवश्यक समय को कम करने के लिए योगदान कर सकते हैं।
Abstract
-omics प्रौद्योगिकियों संभावित दवाओं की इन विट्रो विषाक्तता परीक्षण के लिए नए क्षितिज खोल के साथ कुशल प्रोटोकॉल संयोजन में विभिन्न ऊतकों को मानव स्टेम कोशिकाओं को अलग करने के लिए। ऐसे assays के लिए एक ठोस वैज्ञानिक आधार प्रदान करने के लिए, यह विकास के समय के पाठ्यक्रम पर और प्रणालियों जीव विज्ञान के दृष्टिकोण से अंतर्निहित नियामक तंत्र पर मात्रात्मक जानकारी हासिल करने के लिए महत्वपूर्ण होगा। दो assays के इसलिए इन आवश्यकताओं के लिए यहाँ देखते हैं। UKK परीक्षा प्रणाली में, मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESC) (या अन्य pluripotent कोशिकाओं) अनायास तीनों जनन परतों की कोशिकाओं की पीढ़ी अनुमति देने के लिए, embryoid निकायों में 14 दिनों के लिए अंतर करने के लिए छोड़ दिया जाता है। इस प्रणाली के शुरू में मानव भ्रूण के विकास की महत्वपूर्ण कदम स्मरण दिलाता है, और कोशिकाओं भेदभाव के दौरान रसायनों के संपर्क में हैं, अगर यह मानव विशिष्ट जल्दी भ्रूण विषाक्तता / teratogenicity भविष्यवाणी कर सकते हैं। UKN1 परीक्षा प्रणाली एक populat को फर्क hESC पर आधारित हैneuroectodermal पूर्वज के आयन (एनईपी) 6 दिनों के लिए कोशिकाओं। इस प्रणाली के शुरू तंत्रिका विकास का स्मरण दिलाता है और जल्दी विकास न्यूरोटॉक्सिटी और रसायनों से चालू होने epigenetic परिवर्तन भविष्यवाणी की है। दोनों प्रणालियों, transcriptome माइक्रोएरे अध्ययन के साथ संयोजन में, विषाक्तता बायोमार्कर की पहचान करने के लिए उपयुक्त हैं। इसके अलावा, वे सिस्टम जीव विज्ञान के विश्लेषण के लिए इनपुट डेटा उत्पन्न करने के लिए संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है। ये परीक्षण प्रणाली जानवरों की बड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है पारंपरिक विषाक्तता अध्ययन से अधिक लाभ है। परीक्षा प्रणाली दवा के विकास और रासायनिक सुरक्षा मूल्यांकन के लिए लागत में कमी करने के लिए योगदान कर सकते हैं। उनका संयोजन विशेष रूप से विशेष रूप से की भविष्यवाणी को प्रभावित कर सकते हैं कि यौगिकों पर प्रकाश डालता है।
Introduction
विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में अंतर करने के लिए मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESC) की क्षमता के लिए इन विट्रो विषाक्तता परीक्षण 1, रोग मॉडलिंग और पुनर्योजी चिकित्सा 2 के एक नए युग खोला। स्टेम कोशिकाओं को स्वयं को दोहराने की क्षमता, उनके pluripotent राज्य रखने के लिए, और विशेष कोशिकाओं 3,4 में अंतर करने के साथ संपन्न होते हैं। hESC के गुणों को भी इस तरह के मानव प्रेरित स्टेम सेल (hiPSC) या परमाणु हस्तांतरण 5 द्वारा उत्पन्न कोशिकाओं के रूप में अन्य मानव स्टेम सेल, में पाए जाते हैं (क्षमता के सभी प्रमुख प्रकार की कोशिकाओं को अलग करने के लिए)। उदाहरण के लिए, कई अलग अलग hESC लाइनों कोशिकाओं 13,14 तरह न्यूरॉन्स 6, गुर्दे की कोशिकाओं 7, तंत्रिका शिखा कोशिकाओं 8, cardiomyocytes 9-12, या hepatocytes में विभक्त किया गया है। इसके अलावा, hESC अनायास embryoid निकायों (ईबीएस) 19,20 में तीनों जनन परतें 15-18 की कोशिकाओं में अंतर कर सकते हैं। एआर्ली भ्रूण के विकास के माइक्रोएरे प्रौद्योगिकी का उपयोग करते हुए 15 transcriptomics द्वारा mRNA के स्तर पर कब्जा कर लिया गया है, जो अलग जनन स्तर से संबंधित विभिन्न जीनों के अंतर अभिव्यक्ति के द्वारा नियंत्रित किया जाता है। इन प्रयासों hESC / hiPSC और transcriptomics विश्लेषण (समीक्षा के लिए 21,22 देखें) पर आधारित अंग विशिष्ट विषाक्तता के मॉडल की स्थापना में हुई। इन मॉडलों को प्रयोगशाला पशुओं हमेशा मानव सुरक्षा की भविष्यवाणी नहीं कर रहे हैं का उपयोग कर पूर्व नैदानिक अध्ययन के रूप में विषाक्तता अध्ययन के लिए प्रयोगशाला पशुओं के पारंपरिक उपयोग से अधिक लाभ है। रोगियों का सामना करना पड़ा प्रेरित दवा विषाक्तता अक्सर मानव और प्रायोगिक पशुओं के बीच अलग है कि चयापचय या सिगनल प्रक्रियाओं से संबंधित हैं। प्रजातियों का अंतर मनुष्यों में विकासात्मक विषाक्तता के विश्वसनीय जल्दी पता लगाने को रोका गया है, और इस तरह के thalidomide के 23,24 और diethylstilbestrol 25,26 के रूप में उदाहरण के लिए दवाओं की वजह से teratogenicity को बाजार से वापस ले लिया गया। थालीdomide चूहों या चूहों में किसी भी विकासात्मक विषाक्तता नहीं दिखाया गया है। ऐसे मिथाइल पारा 27 के रूप में पर्यावरण रसायन विभिन्न प्रजातियों में तंत्रिका तंत्र के लिए सम्मान के साथ जन्म के पूर्व विकासात्मक विषाक्तता में हुई है, लेकिन मानव अभिव्यक्तियों जानवरों में मॉडल के लिए मुश्किल हो गया है। प्रजातियों विशिष्टता मुद्दों की समस्या का समाधान करने के लिए, विभिन्न परियोजनाओं के तहत काम कर रहे वैज्ञानिकों आदि को संदिग्ध मानव विषैले पदार्थ का उपयोग कर भ्रूण विषाक्तता, न्यूरोटॉक्सिटी, cardiotoxicity, हेपटोटोक्सिसिटी और nephrotoxicity के लिए विभिन्न मॉडलों के विकास में लगे हुए हैं ReProTect, ESNATS, जासूस की तरह स्टेम कोशिकाओं पर आधारित मनुष्य प्रभावित करते हैं। यूरोपीय संघ परियोजना 'भ्रूणीय स्टेम सेल आधारित उपन्यास वैकल्पिक परीक्षण रणनीतियाँ (ESNATS)' के तहत पांच परीक्षा प्रणाली स्थापित की गई हैं। एक परीक्षा प्रणाली तथाकथित UKK (यू niversitäts कश्मीर linikum कश्मीर OLN) परीक्षा प्रणाली आंशिक रूप से जल्दी मानव भ्रूण के विकास को दर्शाता है। इस एस मेंystem मानव भ्रूण H9 कोशिकाओं तीन रोगाणु परतों (बाहरी झिल्ली, अन्तर्जनस्तर और mesoderm) 15 और रोगाणु परत विशिष्ट हस्ताक्षरों Affymetrix माइक्रोएरे मंच का उपयोग प्रोफ़ाइल transcriptomics द्वारा कब्जा कर लिया गया है करने के लिए में भेदभाव कर रहे हैं। Thalidomide के 28, वैल्प्रोइक एसिड, मिथाइल पारा 16,17, या साइटोसिन arabinoside 15 की तरह विभिन्न विकासात्मक विषैले पदार्थ इस प्रणाली में परीक्षण किया गया है, और विषैला विशिष्ट जीन हस्ताक्षरों प्राप्त किया गया है। एक दूसरे परीक्षा प्रणाली में है, इसलिए परीक्षा प्रणाली 1 UKN1 (कश्मीर onsta एन जेड यू niversity) कहा जाता है, H9 कोशिकाओं 6 दिनों के लिए neuroectodermal पूर्वज कोशिकाओं (एनईपी) को भेदभाव कर रहे हैं। यह एक ऐसी Pax6 और OTX2 के रूप में तंत्रिका जीन मार्कर की उच्च अभिव्यक्ति इसका सबूत है। भेदभाव के दौरान 6 दिनों के लिए, एनईपी कोशिकाओं VPA, मिथाइल पारा के रूप में विकास न्यूरो विषैले पदार्थ को उजागर किया गया है। विषैला-विशिष्ट डे-विनियमित transcriptomics प्रोफाइल के obtai किया गया हैAffymetrix माइक्रोएरे मंच 16,29 का उपयोग करके के रूप में अच्छी तरह से नेड।
21 वीं सदी के विष विज्ञान के लिए नई दृष्टि परीक्षण प्रणाली लंबी अवधि विषैला incubations के अंत में vivo में ऊतकविकृतिविज्ञानी, या transcriptome परिवर्तन की तरह प्ररूपी विवरण उपज ऐसा नहीं कि सिर्फ परिकल्पना की गई है। बल्कि यह assays के यंत्रवत जानकारी 3 प्रदान करते हैं, और कहा कि इस जानकारी को तथाकथित करने के लिए मैप किया जा सकता है पता चलता है कि प्रतिकूल परिणाम रास्ते (एओपी) खतरनाक प्रभाव 30 के लिए एक वैज्ञानिक तर्क है कि प्रदान की। इस तरह की जानकारी उपलब्ध कराने के लिए आवेदन किया परीक्षण प्रणाली उच्च गुणवत्ता मजबूत मानक संचालन प्रक्रियाओं द्वारा प्रलेखित उदाहरण के लिए, के रूप में 31 से नियंत्रित किया जाना है। इसके अलावा, समय पर निर्भर परिवर्तन उच्च संकल्प के साथ मैप किए जाने की जरूरत है। इस सिंक्रनाइज़ परिवर्तन 32 के साथ परीक्षण प्रणाली की आवश्यकता है। यहाँ वर्णित UKN1 और UKK परीक्षण प्रणाली इन आवश्यकताओं के लिए अनुकूलित किया गया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
विषाक्तता परीक्षण करने के लिए परंपरागत दृष्टिकोण इस प्रकार के परीक्षण महंगा है और समय लेने वाली बनाने व्यापक जानवरों के अध्ययन शामिल है। इसके अलावा, interspecies मतभेद के कारण पूर्व नैदानिक पशु सुरक्षा अध?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank M. Kapitza, Margit Henry, Tamara Rotshteyn, Susan Rohani and Cornelia Böttinger for excellent technical support. This work was supported by grants from the German Research Foundation (RTG 1331) and the German Ministry for Research (BMBF).
Materials
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320082 | Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12 |
| KOSR | Life Technologies | 10828028 | Knockout Serum Replacement |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | GlutaMAX supplement |
| NEAA | Life Technologies | 11140050 | MEM Nonessential Amino Acids Solution |
| DPBS | Life Technologies | 14190-0144 | Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, without calcium, without magnesium |
| mTeSR medium | Stemcell Technologies | 5850 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | |
| V bottom plate | VWR | 734-0483 | Plate,Microwell,V BTTM,96 Well,Sterile 1 * 50 ST |
| Vbottom plate lid | VWR | 634-0011 | Lid, Microtitre plates, Cond. Ring 1 * 50 ST |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | Penicillin- Streptomycin, Liquid |
| Distilled Water | Life Technologies | 15230-089. | Sterile Distilled Water |
| Human FGF-2 (bFGF) | Millipore | GF003AF-100UG | Fibroblast Growth Factor basic, human recombinant, animal-free |
| Filter 0.22 μm | Millipore | SCGPU02RE | Stericup-GP, 0.22 μm, polyethersulfone, 250 ml, radio- sterilized |
| StemPro EZPassageTM Disposablte | Invitrogen | 23181010 | |
| BD MatrigelTM, hESC qualified Matrix | Stemcell Technologies | 354277 | 5 ml vial |
| DMSO | Sigma | D-2650 | |
| RNAlater Stabilization Solution | Life Technologies | AM7020 | It stabilizes and protect the RNA integrity in unfrozen samples. |
| 70 μm Cell Strainer | Becton Dickinson | 352350 | Cell strainer with 70 μm Nylon mesh |
| 35 μm Lid cell strainer, 5 ml tube | Becton Dickinson | 352235 | 5 ml polystyrene round bottom test tube, with a cell strainer cap (35 μm) |
| 50 ml sterile Polypropylene tube | Greiner Bio-One | 227261 | 50 ml Polypropylene tube with conical bottom, Sterile |
| T75 flask | Greiner Bio-One | 658175 | CELLSTAR Filter Cap Cell Culture 75 cm2 Flasks |
| TRIzol | Life Technologies | 10296010 | |
| 96 well optical bottom plates | Thermo Scientific | 165305 | |
| CellTiter-Blue | Promega | G8081 | |
| Accutase | PAA | L11-007 | |
| Apotransferin | Sigma-Aldrich | T-2036 | |
| Dispase | Worthington Biochemicals | LS002104 | |
| Dorsomorphin | Tocris Bioscience | 3093 | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| FBS | PAA | A15-101 | |
| FGF-2 | R&D Systems | 233-FB | |
| Gelatine | Sigma-Aldrich | G1890-100G | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-100G | |
| GlutaMAX | Gibco Invitrogen | 35050-038 | |
| HEPES | Gibco Invitrogen | 15630-056 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-6634 | |
| Knockout DMEM | Gibco Invitrogen | 10829-018 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Noggin | R&D Systems | 719-NG | |
| PBS | Biochrom AG | L1825 | |
| Progesteron | Sigma-Aldrich | P7556 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P-5780 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | Tocris Biosciences | 1254 | |
| SB431542 | Tocris Biosciences | 1614 | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0416 | |
| Selenium | Sigma-Aldrich | S-5261 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco Invitrogen | 31350-010 | |
| List of Kits | |||
| RNeasy Mini Kit (250) | QIAGEN | 74106 | |
| GeneChip Hybridization, Wash, and Stain Kit | Affymetrix | 900721, 22, 23 | This kit provides all reagents required for hybridization wash and staining of microarrays. |
| Rnase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | |
| List of equipment. | |||
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Genechip Hybridisation Oven – 645 | Affymetrix | ||
| Genechip Fluidics Station-450 | Affymetrix | ||
| Affymetrix Gene-Chip Scanner-3000-7 G | Affymetrix | ||
| Spectramax M5 | Molecular Devices | ||
| List of softwares | |||
| Prism 4 | |||
| Affymetrix GCOS | |||
| Partek Genomic Suite 6.25 | |||
| Online tools for Functional annotation DAVID Onto-tools Intelligent Systems and Bioinformatics Laboratory |
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Referenzen
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