תאי גזע אנושיים pluripotent בהתבסס התפתחותית רעילות מבחני לביולוגיה הקרנה ומערכות בטיחות כימית נתונים דור
Summary
הפרוטוקולים מתארים שתי מערכות במבחנת רעילות התפתחותית מבחן (UKK וUKN1) המבוססים על תאי גזע עובריים אנושיים ומחקרי transcriptome. מערכות הבדיקה לחזות סיכון לרעילות התפתחותית אדם, ועשויות לתרום לצמצום ניסויים בבעלי חיים, עלויות והזמן הנדרשים לבדיקת בטיחות כימית.
Abstract
פרוטוקולים יעילים להבחין בתאי גזע pluripotent אנושיים לרקמות שונות בשילוב עם טכנולוגיות -omics פתחו אופקים חדשים במבחנה בדיקת רעילות של תרופות פוטנציאליות. כדי לספק בסיס מדעי מוצק למבחנים כאלה, זה יהיה חשוב כדי לקבל מידע כמותי על מהלך התפתחות הזמן ועל מנגנוני פיקוח הבסיסיים על ידי גישות ביולוגיה מערכות. שני מבחני ולכן היו מכוון כאן לדרישות אלה. במערכת בדיקת UKK, תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) (או תאי pluripotent אחרים) נותרים להבדיל באופן ספונטני במשך 14 ימים בגופי embryoid, כדי לאפשר יצירה של תאים של כל שלוש השכבות הנבט. מערכת זו משחזרת שלבים עיקריים של התפתחות עוברית אנושית המוקדמת, וזה יכול לחזות רעילות / teratogenicity העוברי מוקדם אדם ספציפי, אם תאים נחשפים לכימיקלים בבידול. מערכת בדיקת UKN1 מבוססת על הבחנה hESC לpopulatיון של אב neuroectodermal (NEP) תאים במשך 6 ימים. מערכת זו משחזרת את התפתחות עצבית מוקדמת וצופה ברעילויות התפתחותית מוקדמות ושינויים אפיגנטיים מופעלים על ידי כימיקלים. שני המערכות, בשילוב עם לימודי microarray transcriptome, מתאימות לזיהוי סמנים ביולוגיים רעילים. יתר על כן, הם יכולים לשמש בשילוב כדי ליצור נתוני קלט לניתוח מערכות ביולוגיים. יש מערכות בדיקה אלה יתרונות על פני לימודי טוקסיקולוגי המסורתיים הדורשים כמויות גדולות של בעלי חיים. מערכות הבדיקה עשויות לתרום להפחתת העלויות לפיתוח תרופות והערכת בטיחות הכימית. שילובם שופך אור בעיקר על תרכובות שיכולות להשפיע על התפתחות נוירולוגית ספציפית.
Introduction
היכולת של תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) להתמיין לסוגים שונים של תאים נפתחה עידן חדש של בדיקות במבחנה רעילות 1, דוגמנות מחלה ורפואה רגנרטיבית 2. תאי הגזע הם ניחן ביכולת לשכפל את עצמו, כדי לשמור על מדינת pluripotent, ולהתמיין לתאים מתמחים 3,4. המאפיינים של hESC (יכולת להבחין לכל סוגי התאים) נמצאים גם בתאים אחרים אדם pluripotent גזע, כגון תאים אנושיים הנגרם pluripotent גזע (hiPSC) או תאים שנוצרו על ידי העברת גרעין 5. לדוגמא, קווי hESC שונים רבים כבר הבדיל לתוך הנוירונים 6, תאי כליה 7, 8 תאי רכס עצביים, cardiomyocytes 9-12, או hepatocytes כמו תאים 13,14. יתר על כן, באופן ספונטני hESC יכול להתמיין לתאים של כל שלוש השכבות הנבט 15-18 בגופי embryoid (EBS) 19,20. Eהתפתחות עוברית קארלי מוסדרת על ידי ביטוי ההפרש של גנים שונים הקשורים לשכבות הנבט השונות שכבר נתפסו ברמת ה- mRNA על ידי transcriptomics באמצעות טכנולוגית microarray 15. מאמצים אלה הביאו להקמתה של מודלים טוקסיקולוגי ספציפיים איבר מבוססים על hESC / hiPSC וניתוח transcriptomics (לסקירה ראה 21,22). יש מודלים אלה יתרונות על פני השימוש המסורתי של חיות מעבדה ללימודי טוקסיקולוגי, כמחקרים פרה-קליניים בבעלי החיים במעבדה לא תמיד חזוי של בטיחות אנושית. רעילויות התרופה מושרה נתקלו בחולים לעתים קרובות הקשורים לתהליכים מטבוליים או איתות ששונה בין בני האדם ובעלי חיים. הבדל המין מנע הגילוי המוקדם אמין של רעילות התפתחותית בבני אדם, ועבור תרופות למשל כמו תלידומיד 23,24 וdiethylstilbestrol 25,26 הוצא מהשוק בשל teratogenicity. טאליdomide לא הראה כל רעילות התפתחותית בחולדות או עכברים. כימיקלים סביבתיים כגון מתיל-כספית 27 גרמו לרעילות התפתחותית טרום לידתי ביחס למערכת העצבים במינים שונים, אבל גילויים אנושיים היו קשים לדגמן בבעלי חיים. כדי לטפל בבעיה של נושאים ספציפיים מינים, מדענים עובדים תחת פרויקטים שונים המבוססים על תאי גזע כמו ReProTect, ESNATS, בלש וכו 'עוסקים בפיתוח מודלים שונים לרעילות עוברית, רעילויות, קרדיאלית, רעילות וNephrotoxicity באמצעות רעלי אדם חשודים להשפיע על בני אדם. במסגרת פרויקט קונסורציום האירופי 'אלטרנטיבי בדיקת האסטרטגיות חדשניות המבוססות על תאי גזע עובריים (ESNATS) חמש מערכות בדיקה הוקמו. UKK שנקרא (niversitäts k K OLN U linikum) מערכת מערכת מבחן אחד מבחן באופן חלקי לוכדת התפתחות עוברית אנושית מוקדמת. בזה זההתאים העובריים האנושיים ystem H9 נבדלים בשלוש שכבות נבט (האאקטודרם, האנדודרם והמזודרם) 15 ושכבת נבט חתימות ספציפיות כבר נתפסו על ידי transcriptomics פרופיל באמצעות פלטפורמת microarray Affymetrix. רעלים התפתחותיים שונים כמו תלידומיד 28, חומצה ולפרואית, מתיל-כספית 16,17, או arabinoside ציטוזין 15 נבדקו במערכת זו, וחתימות גן toxicant ספציפי התקבלו. במערכת בדיקה שנייה, שנקרא (niversity U של K onsta n z) UKN1 מערכת בדיקה 1, תאי H9 נבדלים לתאי neuroectodermal (NEP) במשך 6 ימים. עדות לכך הוא ביטוי גבוה של סמנים גנטיים עצביים כגון Pax6 וOTX2. במהלך התמיינות במשך 6 ימים, תאי NEP נחשפו לנוירו-התפתחותית רעלים כגון VPA, מתיל-כספית. פרופילי transcriptomics מוסדר דה toxicant ספציפי היו obtaiנד, כמו גם על ידי שימוש בפלטפורמת microarray Affymetrix 16,29.
החזון החדש לטוקסיקולוגיה של המאה ה -21 חוזה שמערכות בדיקה לא רק להניב תיאור פנוטיפי כמו histopathology in vivo, או שינויי transcriptome בסוף incubations toxicant לטווח ארוך. זה לא מצביע על כך שמבחנים לספק מידע מכניסטית 3, וכי מידע זה יכול להיות ממופה למה שנקרא מסלולי תוצאה שליליים (AOP) המספקים רציונל מדעי לתופעות מסוכנות 30. לספק מידע כזה, יש לי מערכות הבדיקה להחיל להיות מאוד איכות מבוקרת 31, כמו למשל תועד על ידי נהלי פעולה סטנדרטיים חזקים. יתר על כן, שינויים תלויי זמן צריכים להיות ממופים עם רזולוציה גבוהה. זה דורש מערכות בדיקה עם שינויים מסונכרנים 32. מערכות בדיקת UKN1 וUKK המתוארות כאן כבר מותאמות לדרישות אלה.
Protocol
Representative Results
Discussion
גישות מסורתיות לבדיקה טוקסיקולוגית כרוכות מחקרים בבעלי חיים רבים ובכך בדיקה יקרה וגוזל זמן. יתר על כן, בשל הבדלי interspecies המחקרים פרה-קליניים בבעלי החיים בטיחות לא תמיד תקפים לחזות השפעות רעילות של תרופות פוטנציאליות רלוונטיות לבני אדם. למרות פרימטים לא אנושיים הם צפ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank M. Kapitza, Margit Henry, Tamara Rotshteyn, Susan Rohani and Cornelia Böttinger for excellent technical support. This work was supported by grants from the German Research Foundation (RTG 1331) and the German Ministry for Research (BMBF).
Materials
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320082 | Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12 |
| KOSR | Life Technologies | 10828028 | Knockout Serum Replacement |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | GlutaMAX supplement |
| NEAA | Life Technologies | 11140050 | MEM Nonessential Amino Acids Solution |
| DPBS | Life Technologies | 14190-0144 | Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, without calcium, without magnesium |
| mTeSR medium | Stemcell Technologies | 5850 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | |
| V bottom plate | VWR | 734-0483 | Plate,Microwell,V BTTM,96 Well,Sterile 1 * 50 ST |
| Vbottom plate lid | VWR | 634-0011 | Lid, Microtitre plates, Cond. Ring 1 * 50 ST |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | Penicillin- Streptomycin, Liquid |
| Distilled Water | Life Technologies | 15230-089. | Sterile Distilled Water |
| Human FGF-2 (bFGF) | Millipore | GF003AF-100UG | Fibroblast Growth Factor basic, human recombinant, animal-free |
| Filter 0.22 μm | Millipore | SCGPU02RE | Stericup-GP, 0.22 μm, polyethersulfone, 250 ml, radio- sterilized |
| StemPro EZPassageTM Disposablte | Invitrogen | 23181010 | |
| BD MatrigelTM, hESC qualified Matrix | Stemcell Technologies | 354277 | 5 ml vial |
| DMSO | Sigma | D-2650 | |
| RNAlater Stabilization Solution | Life Technologies | AM7020 | It stabilizes and protect the RNA integrity in unfrozen samples. |
| 70 μm Cell Strainer | Becton Dickinson | 352350 | Cell strainer with 70 μm Nylon mesh |
| 35 μm Lid cell strainer, 5 ml tube | Becton Dickinson | 352235 | 5 ml polystyrene round bottom test tube, with a cell strainer cap (35 μm) |
| 50 ml sterile Polypropylene tube | Greiner Bio-One | 227261 | 50 ml Polypropylene tube with conical bottom, Sterile |
| T75 flask | Greiner Bio-One | 658175 | CELLSTAR Filter Cap Cell Culture 75 cm2 Flasks |
| TRIzol | Life Technologies | 10296010 | |
| 96 well optical bottom plates | Thermo Scientific | 165305 | |
| CellTiter-Blue | Promega | G8081 | |
| Accutase | PAA | L11-007 | |
| Apotransferin | Sigma-Aldrich | T-2036 | |
| Dispase | Worthington Biochemicals | LS002104 | |
| Dorsomorphin | Tocris Bioscience | 3093 | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| FBS | PAA | A15-101 | |
| FGF-2 | R&D Systems | 233-FB | |
| Gelatine | Sigma-Aldrich | G1890-100G | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-100G | |
| GlutaMAX | Gibco Invitrogen | 35050-038 | |
| HEPES | Gibco Invitrogen | 15630-056 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-6634 | |
| Knockout DMEM | Gibco Invitrogen | 10829-018 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Noggin | R&D Systems | 719-NG | |
| PBS | Biochrom AG | L1825 | |
| Progesteron | Sigma-Aldrich | P7556 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P-5780 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | Tocris Biosciences | 1254 | |
| SB431542 | Tocris Biosciences | 1614 | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0416 | |
| Selenium | Sigma-Aldrich | S-5261 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco Invitrogen | 31350-010 | |
| List of Kits | |||
| RNeasy Mini Kit (250) | QIAGEN | 74106 | |
| GeneChip Hybridization, Wash, and Stain Kit | Affymetrix | 900721, 22, 23 | This kit provides all reagents required for hybridization wash and staining of microarrays. |
| Rnase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | |
| List of equipment. | |||
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Genechip Hybridisation Oven – 645 | Affymetrix | ||
| Genechip Fluidics Station-450 | Affymetrix | ||
| Affymetrix Gene-Chip Scanner-3000-7 G | Affymetrix | ||
| Spectramax M5 | Molecular Devices | ||
| List of softwares | |||
| Prism 4 | |||
| Affymetrix GCOS | |||
| Partek Genomic Suite 6.25 | |||
| Online tools for Functional annotation DAVID Onto-tools Intelligent Systems and Bioinformatics Laboratory |
|||
Referenzen
- Liu, W. W., Deng, Y. G., Liu, Y., Gong, W. R., Deng, W. B. Stem Cell Models for Drug Discovery and Toxicology Studies. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 27 (1), 17-27 (2013).
- Zuba-Surma, E. K., Jozkowicz, A., Dulak, J. Stem Cells in Pharmaceutical Biotechnology. Current Pharmaceutical Biotechnology. 12 (11), 1760-1773 (2011).
- Leist, M., Hartung, T., Nicotera, P. The dawning of a new age of toxicology. ALTEX. 25 (2), 103-114 (2008).
- Kuegler, P. B., et al. Markers of murine embryonic and neural stem cells, neurons and astrocytes: reference points for developmental neurotoxicity testing. ALTEX. 27 (1), 17-42 (2010).
- Yamada, M., et al. Human oocytes reprogram adult somatic nuclei of a type 1 diabetic to diploid pluripotent stem cells. Nature. , (2014).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature cell biology. 16 (1), 118-126 (2014).
- Zimmer, B., et al. Evaluation of Developmental Toxicants and Signaling Pathways in a Functional Test Based on the Migration of Human Neural Crest Cells. Environmental Health Perspectives. 120 (8), 1116-1122 (2012).
- Bosman, A., et al. Molecular and Functional Evidence of HCN4 and Caveolin-3 Interaction During Cardiomyocyte Differentiation from Human Embryonic Stem Cells. Stem Cells and Development. 22 (11), 1717-1727 (2013).
- Sartiani, L., et al. Developmental changes in cardiomyocytes differentiated from human embryonic stem cells: A molecular and electrophysiological approach. Stem Cells. 25 (5), 1136-1144 (2007).
- Xu, X. Q., et al. Chemically defined medium supporting cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells. Differentiation. 76 (9), 958-970 (2008).
- Pal, R., Mamidi, M. K., Das, A. K., Bhonde, R. Comparative analysis of cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells under 3-D and 2-D culture conditions. Journal of Bioscience and Bioengineering. 115 (2), 200-206 (2013).
- Subramanian, K., et al. Spheroid Culture for Enhanced Differentiation of Human Embryonic Stem Cells to Hepatocyte-Like Cells. Stem Cells and Development. 23 (2), 124-131 (2014).
- Sivertsson, L., Synnergren, J., Jensen, J., Bjorquist, P., Ingelman-Sundberg, M. Hepatic Differentiation and Maturation of Human Embryonic Stem Cells Cultured in a Perfused Three-Dimensional Bioreactor. Stem Cells and Development. 22 (4), 581-594 (2013).
- Jagtap, S., et al. Cytosine arabinoside induces ectoderm and inhibits mesoderm expression in human embryonic stem cells during multilineage differentiation. British Journal of Pharmacology. 162 (8), 1743-1756 (2011).
- Krug, A. K., et al. Human embryonic stem cell-derived test systems for developmental neurotoxicity: a transcriptomics approach. Archives of Toxicology. 87 (1), 123-143 (2013).
- Leist, M., et al. Test systems of developmental toxicity: state-of-the art and future perspectives. Archives of Toxicology. 87 (12), 2037-2042 (2013).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Molecular medicine. 6 (2), 88-95 (2000).
- Khoo, M. L. M., et al. Growth and differentiation of embryoid bodies derived from human embryonic stem cells: Effect of glucose and basic fibroblast growth factor. Biology of Reproduction. 73 (6), 1147-1156 (2005).
- Son, M. Y., Kim, H. J., Kim, M. J., Cho, S. Physical Passaging of Embryoid Bodies Generated from Human Pluripotent Stem Cells. Plos One. 6 (5), (2011).
- Winkler, J., Sotiriadou, I., Chen, S., Hescheler, J., Sachinidis, A. The potential of embryonic stem cells combined with -omics technologies as model systems for toxicology. Current medicinal chemistry. 16 (36), 4814-4827 (2009).
- Gunaseeli, I., Doss, M. X., Antzelevitch, C., Hescheler, J., Sachinidis, A. Induced pluripotent stem cells as a model for accelerated patient- and disease-specific drug discovery. Current medicinal chemistry. 17 (8), 759-766 (2010).
- Miller, M. T., Stromland, K. Teratogen update: Thalidomide: A review, with a focus on ocular findings and new potential uses. Teratology. 60 (5), 306-321 (1999).
- Newman, C. G. H. Teratogen Update – Clinical Aspects of Thalidomide Embryopathy – A Continuing Preoccupation. Teratology. 32 (1), 133-144 (1985).
- Stern, L. In vivo assessment of the teratogenic potential of drugs in humans. Obstetrics and gynecology. 58 (5 Suppl), 3S-8S (1981).
- Lynch, H. T., Reich, J. W. Diethylstilbestrol, Genetics, Teratogenesis, and Tumor Spectrum in Humans. Medical Hypotheses. 16 (3), 315-332 (1985).
- Satoh, H. Behavioral teratology of mercury and its compounds. Tohoku Journal of Experimental Medicine. 201 (1), 1-9 (2003).
- Meganathan, K., et al. Identification of Thalidomide-Specific Transcriptomics and Proteomics Signatures during Differentiation of Human Embryonic Stem Cells. Plos One. 7 (8), (2012).
- Balmer, N. V., et al. Epigenetic changes and disturbed neural development in a human embryonic stem cell-based model relating to the fetal valproate syndrome. Human Molecular Genetics. 21 (18), 4104-4114 (2012).
- Smirnova, L., Hogberg, H. T., Leist, M., Hartung, T. Developmental neurotoxicity – Challenges in the 21st Century and In Vitro Opportunities. ALTEX. 31 (2), 129-156 (2014).
- Leist, M., Efremova, L., Karreman, C. Food for thought … considerations and guidelines for basic test method descriptions in toxicology. ALTEX. 27 (4), 309-317 (2010).
- Zimmer, B., et al. Coordinated waves of gene expression during neuronal differentiation of embryonic stem cells as basis for novel approaches to developmental neurotoxicity testing. Cell Death and Differentiation. 18 (3), 383-395 (2011).
- Kraljevic, S., Stambrook, P. J., Pavelic, K. Accelerating drug discovery. EMBO Reports. 5 (9), 837-842 (2004).
