縦断のために脊髄商工を移植するための手順<em>インビボ</emマウス脊髄の>イメージング

注：この論文でのケアとすべてのマウスの実験的操作は、コーネル大学施設内動物管理使用委員会によって承認された。 1.手術のためのセットアップオートクレーブまたは承認された滅菌手順を使用して、必要なすべてのツールを滅菌する。最低でも、外科用メス、はさみ、ヴァンナはさみ、ピンセット、宝石商のスクリュードライバー、綿棒、リトラクターのセット、インプラント（ 図1A）とその送達システム（ 図1D、E）を含む。 70％エタノールおよび/または適切な消毒薬で、あらゆるステレオスコープ·ノブを含め、すべての表面を拭う。 カスタムstereotax（ 図1D）をオーバーレイし、滅菌ドレープでベンチを囲むことにより、滅菌フィールドを作成します。加熱パッド（好ましくはフィードバック制御）がstereotaxの上にし、滅菌ドレープの下に配置する必要があります。 2.準備手術のためのマウス呼吸速度が約1呼吸/秒に減速するまで、誘導室中で5％イソフルラン/酸素下でマウスを麻酔。 イソフルラン暴露を継続するためにノーズコーンを使用して、無菌のフィールドから離れてステージング領域にマウスを転送します。 2％イソフルランを減らします。角膜の乾燥を防ぐために、眼軟膏を適用します。 肢当たりの注入量の約50％を実現し、30 G針と3/10 1ccシリンジ – 筋肉29を使用して、後肢には0.05mg / 100gのマウスにグリコピロレート（抗コリン薬）を投与する。 NOTE：グリコピロレートは、マウスが麻酔下にある間に、肺内の流体の蓄積を防ぐのに役立つ。 電気バリカンを使用して、幅2cmおよび胸部アーチを中心に、マウスの背側面、約3cmの長さの部分を剃る。十分に離れて剃ったエリアからのトリミング髪をきれいにしてください。 皮下に、次の注射を管理し、坊主頭の遠位に1ミリリットル/（水分補給用）、生理食塩水で100グラムのマウス5％グルコース、5 mg / kgをマウスのケトプロフェン（鎮痛のためのNSAID）、0.2 mg / kgをマウスデキサメタゾン（：30 G針と3/10 ccのシリンジ – 29を使用したパッチ炎症を減少させる抗炎症性ステロイド）。 綿棒を使用して、3つのヨウ素の交互洗浄し、70％エタノールを行い、洗浄の間に1分間の待機。 切開部位の痛みを軽減するために剃ったパッチの中心に30 G針と3/10 1ccシリンジ – 皮下に29を使用して、0.125％ブピバカイン（末梢神経ブロック）の100μlのを管理します。 カスタムstereotax（ 図1D）に転送するマウスは、直腸温度計を挿入し、ブピバカインを有効にするために約10分を待ちます。 3. 3隣接する胸椎の背薄層を露出し、清掃してください手術用メスの刃を使用して、関心のある椎骨（ 図2A）の上にある小さな（5mm以下）切開を作る。 <li>鉗子または手術鋏の先端を挿入し、鈍的切開によって、皮膚の開口部のサイズを大きくし、ハンドルを拡散することによってのいずれかを使用する。 メスまたは外科用ハサミを使用して、優しく肌とその下の筋肉との間の結合筋膜を解離。 できるだけ大きな作業領域（ 図2B）を可能にする、肌をバック保持するために開創を使用してください。胸の負荷を増加させ、それによって呼吸を妨げないように注意してください。 その上の筋肉を介して公開されます吻側 – ほとんどの椎骨は、ピンセットを使用してグリップ。メスを用いて、すべての3つの椎骨（ 図2c）から背側プロセスのいずれかの側に離れて組織を切断する。 手術用メスの刃、綿棒、および/ ​​または骨スクレーパの任意の組み合わせを使用して、背側の薄層（ 図2D）からのすべての上にある組織を除去する。 外科用ハサミを使用して、慎重にLateraの両方の上の椎骨に取り付けられた腱を切り取る脊柱（ 図2E）のLエッジ。 メスを用いて、穏やかに清浄なクランプ面を提供するために、できるだけ脊柱の横方向縁部からできるだけ多くの組織を除去する。 ゆっくりと骨のスクレーパーおよび/または綿棒を使用して、任意の残りの軟組織の椎骨を創面切除。他の場所で外科用ハサミ（ 図2F）を使用して、任意のちぐはぐな組織を離れてトリミング。 注：これは、クランプと脊椎がきれいにさらされていることを背側椎弓切除を行う両方のために不可欠である。焼灼器は、後続の出血を制御するのに有用であり得る。 皮膚（ 図2F）に加えて、脊柱の周囲の組織をバック保持するために開創シフト。 配達ポストに突起にインプラントサイドバーを取り付けます（ 図1Eのように）ポストホルダーにこれらをロードする。 securelを保持するだけの十分な圧力を加えて、サイドバーを使用して3椎骨をクランプY（ 図2G、H）。 3椎骨のレベルクランプを確保するために鉗子を使用してください。いくつかの試みが必要であることに注意してください。サイドバーはレベル前椎弓切除を行うと平行の両方であることを確認してください。 慎重に清潔で綿棒を使用してクランプされた椎骨の背側表面を乾燥させる。 4.背椎弓切除を行います内側クランプされた椎骨の硬膜外腔にvannasハサミの先端を挿入し、軽くハンドルを絞る。骨が乾燥している場合には、背側椎弓の長さに沿って割れなければならない。ラミナを解放するために、反対側には、この手順を繰り返します。 ゆっくりと慎重にラミナの吻側および尾側端にすべての結合組織を離れてカットし、それを離れて持ち上げ、ピンセットで背側プロセスによる緩いラミナを把持する。 0.9％生理食塩水および/または人工脳脊髄液（ACSF）を使用して、徹底的にすべての血液overlyiを洗い流す脊髄をngの。余分な水分を吸収するために綿棒を使用してください。 vannasはさみを使って、慎重に戻ってインプラントのサイドバーに骨の側縁をトリミング。ここでも、洗い流すと綿棒と生理食塩水/ ACSFを使用して出血を制御します。 30 G針 – 骨膜の一部が剥離し、脊髄の上に重なるたことをイベントでは、軽く綿棒および/または29を使用して、この組織を除去する。手順のこの部分で脊髄を傷つけないように注意してください。しっかりと包まれた硬膜とゆるい骨膜を混同しないでください。 慎重に、1または歯科アクリルおよびシアノアクリレート（ 図2I）の両方で骨の残りの露出した縁部をシール。接着剤が露出脊髄上に流れるようにしない特別な注意してください。 5.シール商工 4スロットはサイドバー上の4穴と並ぶと開口部が露出スピンの上に重なるように、慎重に、天板を置きアルコード（ 図1Bおよび2J）。 宝石商のドライバーを使用して、慎重に鉗子の別のペアでねじ回しのシャフトを安定させる、最初のネジを起動します。この段階でネジを締めますが、最初の数のスレッドが従事しているように、それを挿入しないでください。他の3本のネジのためにこのプロセスを繰り返します。 注：この段階での位置にネジを助けるために、チタン又は他の非磁化可能な鉗子を使用することが有用である。 場所内のすべての4本のネジで、ネジはしっかりと（ 図2K）確保されるまで、各少しずつ同量だけ交互にネジ締めます。トッププレートは、このプロセス中に屈曲することは珍しいことではないことに注意してください。ねじの頭が破ることができると、過剰な下向きの圧力がクランプを取り除く及び/または脊髄損傷になりますように、あまりにも多くのネジを締めないように注意してください。 脊髄およびガラス窓との間の空間を充填するシリコーンエラストマーを使用する。それはDOEので、硬化中に酢酸を生成しないS、KwikSilブランドのエラストマーとの混合のヒントを使用しています。暴露脊髄へのシリコーンのリベラルな部分を適用します。混合先端部からの事前の脊髄への適用に気泡を含む任意のシリコーンを取り除くために注意してください。 トッププレートの挿入図に5ミリメートル＃0カバースリップを押す優しく、迅速に作業する。徐々に脊髄を取り囲むように液体エラストマーを絞るが、脊髄圧迫（ 図2L）を生じないための十分な圧力を適用します。エラストマーのための時間を設定すると、約90秒であるため、カバーガラスが急速に適用されていることを確認します。 5.5 – 失敗したシールのイベントでは、エラストマーが設定されるまで、静かにピンセットでインプラントからそれを削除し、5.4を繰り返して待つ。 歯科用アクリル/シアノアクリレートと滲出性エラストマーの縁部をカバーし、脊髄の表面に移動するのエラストマーを防ぐために、できるだけ周囲の骨に付着する。 リトラクターを取り外し、インプラントの縁の周りの皮膚を引き上げ。シアノアクリレートを使用して、インプラント（ 図2M、N）の縁に皮膚に接着する。 1/4 "トッププレート（ 図1Cと2 O）の翼にネジを設定する- ＃0-80を挿入します。 歯科アクリルを使用して、トッププレート（ 図2P）のネジ穴に隙間をシール。 6.術後ケア広々とした清潔なケージに麻酔と場所から動物を削除します。ケージはチャンバーはケージ全体に通常の歩行運動の過程で（例えば、水ボトル及び/または食品用のV字型のディップなど）何にも引っかかるしないことを十分に大きいことを確認してください。 注：標準的なラットケージが理想的です。 動物が回復しつつ加熱された表面にケージを置きます。それは完全に回復するまで、他の動物の会社にマウスを返さないでください。 動物behaを確認してください痛みや苦痛とインプラントの完全性の兆候が2時間の手術後 – 1内のvior。 注：通常の状態では、動物が動きに控えめな摂動に歩き回ることができるはずです。 重量を測定し、行動を監視して、最初の72時間12時間 – 動物ごとに8をチェックし続けます。動物は夜の間にアクティブとモバイルであることを確認してください。水または栄養ゲルと混合地面飼料、飼料ペレット、及び飲料水の形のウェットフードは、グランドレベルで提供されるべきである。皮下またはintraperiotoneal注射による追加の水和は、必要に応じて提供されるべきである。 術後、24および48時間の時点で5 mg / kgをマウスケトプロフェンおよび0.2 mg / kgをマウスのデキサメタゾンを皮下投与する。さらに、0.005から0.010ミリグラム/ 100gのマウスを72時間毎に皮下注射により8時間後に投与されるべきである。 7. in vivoイメージング下のマウスを麻酔誘導室中で5％イソフルラン/酸素呼吸速度は約1呼吸/秒まで減速するまで。 フィードバック制御された加熱パッドでカスタムstereotax（ 図1D）にマウスを移し、直腸温度計を挿入します。 2％イソフルランを減らします。 肢あたりの注入量の約50％を実現し、30 G針と3/10 ccのシリンジ – 29を使用して、後肢にグリコピロ0.05ミリグラム/ 100グラムのマウスの筋肉を管理します。 一度時間あたりの皮下に生理食塩水に1ミリリットル/（水分補給用）100グラムのマウス5％グルコースを管理します。 手術（ 図1F）に使用後の保有者にねじ込ま室ホルダーを挿入します。高さを調整し、トッププレートに止めねじの上にポストをねじる。 両方の所有者が添付して、胸が自由にインスピレーションの際に拡張することができるまで、ポストホルダーにホルダーを高める。 注：所有者の事務所の取り付けと胸significanの自由膨張両TLY呼吸によるモーションアーチファクトを低減。 必要に応じて撮像を行う。 イメージングは​​、チャンバホルダーをオフねじる、下部支柱完了すると、直腸温度計を削除し、回復するために加熱された表面上にマウスを置く。それは完全に回復するまで、他の動物の会社にマウスを返さないでください。