Schnelle und robuste Analyse Zelluläre und Molekulare Polarisation durch Chemokine Signaling Induced

Chemokine sind kleine lösliche Proteine, die Zellen zu spezialisierten Standorten ¹ gewinnen. Daher nehmen sie an der korrekten Positionierung von Zellen in Geweben, eine entscheidende Funktion bei der Entwicklung und Physiologie. Das Immunsystem ist keine Ausnahme von dieser Regel, wie es auf die Einwirkung von vielen verschiedenen Zelltypen, die in einem Strang, um eine wirksame Immunantwort beruht. Durch die Steuerung der spezifischen Position eines Immunzelltyps in einem bestimmten Zustand sind Chemokine vorge erforderlich, bevor Fremdantigene erkannt und neutralisiert werden.

In T-Lymphozyten, insbesondere Chemokine binden an spezifische Oberflächenrezeptoren, die bei Eingriff, entlocken viele intrazelluläre Signale (Calcium-Anstieg, ERK Phosphorylierung, Rho-GTPasen Aktivierung Anstieg der Integrine Affinität und Zytoskelett-Änderungen), die T-Zell-Motilität ^2,3 begünstigen. Auf zellulärer Ebene kann eine morphologische Veränderungen bei Chemokin Stimulation ausgelöst beobachten.Diese Veränderungen in der Zellformen sind besonders dramatisch in T-Zellen: ruhende T-Zellen bei Reisen in den Blutstrom über eine wulstartige runde Morphologie. Jedoch ist die Erfassung der Gegenwart von Chemokinen an Entzündungsstellen oder zumin Nähe Lymphorganen gehen, um die Form von T-Zellen, die nun eine typische "hand-Spiegel" Morphologie, bestehend aus einer bipolaren Form annehmen ändern: eine führende Kante an der Vorderseite und eine Hinterkante oder Uropod, an der Rückseite ^4. Darüber hinaus kann die intrazelluläre Komponenten in diesen zwei gegenüberliegenden Bereichen eines polarisierten T-Zelle zu trennen, um die Migration zu erhalten. Beispielsweise Aktinfilamente Polymerisation steigt auf Chemokin Stimulation ⁵ und polymerisierten Actin reichert sich an der Vorderseite eines polarisierten T-Zelle ^2. Auf der anderen Seite, mehrere Proteine, wie phosphorylierte Proteine ​​der Ezrin-Radixin-Moesin (ERM) -Familie, die Plasmamembran zu der kortikalen F-Aktin zu verbinden, erneut lokalisiert am Uropod polarisierterT-Zellen ^6. Interessanterweise haben wir und andere zeigen, dass diese Polarisierung Prozess wird für T-Zell-Migration erforderlich. Tatsächlich wird jede Behandlung, die mit Polarisations stört zellulären Motilität zu hemmen. Zum Beispiel die Hemmung der Aktivität der Mitglieder der atypischer Proteinkinasen C (PKC) Familie PKCζ und PKCι Blöcke T Zellpolarisation und deren Migrationsscanprozess der dendritischen Zellen ^7. T-Zell-Polarisation auch von Rho-GTPasen geregelt. Wir haben gezeigt, dass die Modulation des RhoL Aktivität durch den kürzlich beschriebenen Fam65b Protein interferiert mit T-Zell-Veränderungen in der Morphologie und ihrer Fähigkeit, in einem Transwell-Assay ⁶ migrieren. Als Polarisations Voraussetzung Schritt zelluläre Motilität ist es daher von entscheidender Bedeutung, um es als eine Haupt Auslesen Chemokin Reaktionen zu quantifizieren. Zellform Veränderungen wurden bisher manuell ⁸ gemessen. Allerdings ist diese Art der Quantifizierung sehr zeitaufwendig, so dass in der Regel nur wenigeZehn Zellen berücksichtigt.

Hier wird ein neues Verfahren vorgestellt, um schnell quantifiziert den Grad der Formänderungen von T-Lymphozyten auf die Stimulation Chemokin ausgesetzt. Eine Abbildungs ​​Durchflusszytometrie-Technologie (siehe Tabelle Spezifische Reagenzien / Equipment) verwendet wird, der die Vorteile eines Durchflusszytometers und ein Mikroskop ⁹ kombiniert, um die Menge des polarisierten Zellen unter verschiedenen Bedingungen von Chemokin Stimulation effizient zu quantifizieren. Zusätzlich zur Quantifizierung der morphologischen Veränderungen, die eine robuste Konstruktion mit dieser Technik gemessen werden kann, ist es auch möglich, Veränderungen der subzellulären Lokalisation von einigen Proteinen bei Chemokinsignalisierung bewerten.