マイクロダイセクションによる開発小脳とは異なる細胞集団の単離

小脳は、それぞれが異なる細胞型を含む、複数の細胞層から構成されている。開発中は、EGLは分子層とプルキンエ層はそれぞれ、バーグマングリアとプルキンエニューロンを含み、一方顆粒ニューロン前駆体（のGNP）が増殖して含まれています。小脳内のディープは、神経幹細胞（NSC）およびオリゴデンドロサイト^1が含まれている白質を、ある。

ソニックヘッジホッグ（Shhが）小脳発生の調節において重要な役割を果たしており、特に、パッチが適用その受容体（PTC）、Shhの^{2-4シグナル}の負の調節因子への結合を介してのGNPの増殖を促進する。 Shhシグナル伝達の異常な活性化は、髄芽腫（MB）、小児^5,6で最も一般的な悪性脳腫瘍を生成します。

PTCミュータントMBトランスジェニックマウスモデルは、MBの研究のための強力なツールであり、人間のMB ^7,8に似た腫瘍を発症。これらを使用したマウスは、それがのGNPはハリネズミ型MB ⁷起源の細胞であることが発見された。さらに、のG​​NPに加えて、私たちは最近、またMBを生じさせることができる開発する小脳のEGL内の神経前駆細胞のユニークな集団を同定した。これらの細胞は、タイプVIの中間フィラメントタンパク質、ネスチンを高レベルで発現し^、9のNEPと呼ばれる。のNEPは、EGLの深部内に配置され、唯一の新生児小脳の開発中に一過的に存在している。彼らはのGNPのような顆粒細胞系譜にコミットしますが、彼 ​​らは静止状態にしてのMath1、従来のGNP ¹⁰のためのよく確立されたマーカーを発現しないように区別されます。さらに、NEPのは彼らMBの腫瘍形成のための新規の原点になりShhのシグナル伝達経路^9、起動後のMBの上昇よりも効率的にのGNPを与える。

私たちは、以前に顕微解剖技術によって生後4日目（P4）での小脳のEGLからのNEPを隔離ここで⁹について説明^した。組織の直接顕微鏡可視化を介したマイクロダイセクションは、小脳のEGLの特定の解剖を可能にします。ネスチンはまた、分子層^1,7,11,12に小脳白質中のNSCによってとバーグマングリアによって発現し、それは彼らが分析を混乱さと同じように、これらの細胞は、含まれていないことが非常に重要でしているように、これが必要です。顕微解剖組織から単離された細胞は、分子分析のために直ちに使用することができ、またはそれらは、さらなる用途のために培養することができる。

具体的にはEGLをmicrodissectingにおいて補助するために、さらなるのNEPを精製する、 のMath1-GFP（緑色蛍光タンパク質）マウスは、 ネスチン-CFP（シアン蛍光タンパク質）マウスと交配した。 Math1または特異的のGNP及びGFPの発現によって発現される転写因子は、EGL ^9,13においてはっきりと見える。 ネスチン-CFPマウスはCFPの核型を発現し、容易に分子層^9,14に視覚化することができる。一緒に、GFPとCFP式がEGLのマイクロダイセクションのための境界を作成します（ 図1を参照）。 CFP陽性のNEPは、その後解剖しEGLsの酵素的解離に続いて、FACSによって単離した。

現在、EGLから細胞を単離するための最もよく利用される方法は、全小脳組織^15,16のパーコール勾配遠心分離である。しかし、この方法は、完全に分子層と白質のネスチン+細胞集団を除外することができないのでのNEPの研究のために使用することができない。関心のある細胞を除去するためにレーザエネルギーの転送を利用するレーザーキャプチャーマイクロダイセクションは、異種の組織^17,18内の特定の細胞を単離するために使用されるが、捕捉された細胞のみがDNA、RNAおよびタンパク質の回収のために使用されないことができる別の方法である培養することができるように。

このプロトコルは、具体的には、EGLからのNEPの生きている、純粋な集団を単離する方法を提供します。この技術は、認識可能な解剖学的アーキテクチャまたは蛍光標識された細胞/領域のいずれかを有する異なる組織タイプに適用することができる。したがって、細胞単離プロトコールにこの新規顕微解剖技術を組み込むの主な利点は、細胞が隣接する組織を汚染除去するために、特定の組織領域から単離することができ、細胞は、他のアプリケーションの分析または培養のためにすぐに収集することができることである。

このプロトコルにおける動物の使用は、フォックスチェイスがんセンター動物実験委員会によって承認された手順に従って行われている。

楽器、ソリューション、およびカバーガラスの作製

1. ＃5細かい鉗子のクリーン二組、＃7の1組の罰金、湾曲鉗子、一つの大きな外科はさみ、1 microdissectingはさみ、1へら一あきスプーン。セルフシール滅菌袋とオートクレーブ中で楽器を置きます。使用するまで袋に楽器を保管してください。
2. 3％の低融点アガロース溶液を調製する。
   1. 気泡が出現するまで、電子レンジ、暑さの中に置くの滅菌ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）50ml中に1.5グラムのアガロースを追加します。スワールフラスコと再加熱すべてアガロースを溶解するまで。塊が現れた場合、加熱前に攪拌棒を備えたソリューションを混ぜる。
   2. 37℃の水浴に保管ソリューションまで、必要に応じ。
   3. 長期的なSTORAG​​用E、カ月間室温または4℃で、将来の使用のためにアガロース溶液を格納します。液化するために、電子レンジで再加熱する。アガロース溶液を繰り返し加熱するために、温かい滅菌蒸留水との初期重量を維持するために加熱する前に、フラスコの重量を量る。
3. 以前に^2に記載され^ているように、パパインベースの細胞解離のために以下の手段を準備します。
   1. 赤含有DPBSを滅菌フェノールでパパイン（100 U / ml）を、システイン（0.2 mg / mlで）およびDNase（250 U / ml）でパパイン溶液。
   2. ウシ血清アルブミンとオボムコイド溶液（BSA; 8 mg / ml）を、大豆トリプシンインヒビター（8 mg / ml）で）およびDNase（250 U / ml）の滅菌フェノールレッドを含有するDPBS中。
      フィルターは両方のソリューションを殺菌し、フェノールレッドを含有するDPBSの元の色を返すようにpHを調整する。
4. 細胞培養培地（NB / B27）を調製：1 mMピルビン酸ナトリウム、2mMのL-グルタミン、1％ペニシリン - ストレプトマイシン（P / S）及びB27サプリメントを基本培地を補う。 FilteR殺菌し、光から保護します。使用前に37℃で媒体を平衡化し、5％CO _2。
5. FACS緩衝液を準備しDPBS中の5％ウシ胎児血清（FBS）を。 47.5ミリリットルのDPBSに2.5ミリリットルのFBSを追加します。
6. ポリ-D-リジン（PDL）でコーティングされたカバースリップを準備します。
   1. オートクレーブ新しいカバーガラス。
   2. コー​​トPDLとカバースリップ（滅菌蒸留水中に100μgの/ ml）を37℃で一晩または室温で2時間インキュベートする。
   3. ウォッシュは、滅菌蒸留水を用いてカバースリップ。 NB / B27培地で一回洗浄する。カバースリップは使用前に、組織培養フード内で完全に乾燥させます。

2解剖と組織スライスの調製

1. 解剖の日に、吸収パッドと、70％のエタノールとカバーで解剖領域を拭う。
2. 滅菌袋から解剖ツールを削除します。氷の上の小さなペトリ皿や場所に氷冷滅菌DPBS / 1％P / Sを追加します。
3. 首を切るP4 のMath1-GF大手術用ハサミでP / ネスチン-CFPの仔マウスを微湾曲した鉗子で頭を押したままにします。皮膚を外し、静かにへらを使って頭蓋骨から脳をかき出すとDPBS / 1％P / Sを含むペトリ皿に移すし、＃5細かい鉗子で頭蓋骨をはがす。
   1. ＃5細かい鉗子を使用して、慎重に脳の他の部分から小脳を分離する。可能な限り迅速に一度に一つの子犬を解剖してください。
   2. 分子·機能解析のための十分なNEPのを得るために、8小脳の最小値を収集します。
4. 3％低融点アガロース溶液で2×2×2cmの埋め込み型を満たす。アガロースの温度はせいぜい37℃ではないことを確認してください。
5. 実験室の組織を軽くたたくことにより、小脳から余分な液体を除去します。縦位置で金型内に小脳を置きます。それはすぐに固化するできるように、氷の上に金型を配置します。ブロックあたり〜4小脳を使用してください。
6. 李を取得振動ブレードビブラトームを用いて組織切片をヴィング。かみそりの刃で小脳を含むアガロースブ​​ロックをトリミング。垂直位置に配向小脳でビブラトーム板にアガロースブ​​ロックを接着。
7. 氷冷滅菌DPBS / 1％P / Sをビブラトームのトレイを記入し、下に氷を置く。
   1. 小脳の全長を通して600μmのセクションをカット。穴あきスプーンを使用して、製氷皿からの切片を収集します。氷上でDPBS / 1％P / Sで満たされたペトリ皿内の場所セクション。

3マイクロダイセクションおよび細胞解離

1. 蛍光解剖顕微鏡下で組織切片を含むペトリ皿を置きます。
   1. CFP +分子層およびGFP + EGL（ 図1の点線を参照）との間での解剖による細かい鉗子を用いて小脳セクションの残りの部分からEGLを慎重に分離。になり、これ分子層の任意の部分を含まないように注意してくださいネスチン発現バーグマングリアの汚染。
   2. 可能な限り迅速に、この手順を完了し、細胞死を回避するために、氷上で組織を維持する。
   3. 次のステップに進む前に、周囲の組織アガロースを削除します。
2. 以前に、単一細胞懸濁液を得るために^、2に記載^のようにパパインベースのプロトコルを使用して顕微解剖EGL組織を消化する。
   1. 再懸濁FACSを介して、CFP-陽性細胞の収集のためのFACS緩衝液で細胞を。

4。セルソーティングおよびめっき

1. 適切なCFPフィルターを含む滅菌、高速フローサイトメーターを使用して、CFP蛍光のソート細胞と氷上で、FACS緩衝液で細胞を集める。各P4小脳からの約10万のNEPを取得します。
2. 5分間300×gで遠心分離した細胞。さらなる実験のための分子解析や培養のために、すぐに細胞を使用してください。
3. 培養細胞に、予め温めておいたNB / B27 mの細胞を再懸濁以前に^2に記載され^ているように、PDLコーティングしたカバーガラス上EDIAとプレート。

図1Aに示すように、小脳スライスは小脳EGLは、GFP発現のGNPによって支配された分子層がCFP陽性グリア細胞によって濃縮された、P4 のMath1-GFP / ネスチン-CFPマウスから調製した。 （; 図1A点線に沿って）EGLの深部に位置しているのNEPを単離するために、スライスは、EGLと分子層の間に顕微解剖された。解剖EGLs（ 図1B）は、次いで、FACS続い酵素的解離のために収集された。

予想されたように、解剖しEGLにおける細胞の大部分（85％以上）は、GFP（ 図2A）について陽性であった従来のGNPであった。のNEP（CFP +）は、EGL細胞集団のわずか約5％を占めている。ほとんどの細胞はいずれも、FACS分析に基づくGFP及びCFPのための二重陽性はなかった。 FACSによって精製CFP +細胞は、分化poteを調べるために、in vitroで培養したntial。 図2（b）に示すように、NEPのはもっぱらβ-チューブリンには、+ニューロンを培養中の4日後に生じた、示唆しているのNEPは系統制限神経細胞前駆細胞である。

この顕微解剖プロトコルで、のNEPとのGNPもEGL PTCに欠損小脳から精製した。頭蓋内移植の際、NEPのはNEPのは癌化⁹を特に受けやすいことを示したGNPと比較してより迅速にMBを開発しています。

EGLマイクロダイセクション用の領域の図1の同定。P4 のMath1-GFP /ネスチン-CFP動物からの蛍光画像。CFPの発現の大部分は分子層に位置している間に、（A）GFP発現は、EGLに位置しています。マイクロダイセクションをtに沿って行われていた彼黄色の点線（B）EGLsが組織解離のために収集した。この図は、Li ら⁹から変更されている。

図2のNEPは、EGLでの細胞の小集団を代表し、系統制限神経細胞前駆細胞である。 （A）は、顕微解剖EGLから単離されたCFP +細胞のフローサイトメトリー分析。（B）のNEP 4日間分化条 ​​件下で培養し、β-チューブリン（赤色）について染色し、DAPI（青色）で対比染色した。この図は、リーらから変更されている^。9

ここで説明顕微解剖法は、分子的および機能的分析において使用するための生細胞の純粋な集団を単離することができる最初の手順である。 Li ら⁹によって実証されるように、 この方法で得られたのNEPを培養し、各種実験に組み込むことができ、その高い純度で、マイクロアレイ分析のためにも使用することができる。

これは顕微解剖技術に習熟するには時間がかかることが非常に重要です。のNEPは、ネスチン発現バーグマングリアはNEP細胞単離を汚染し、純度を損なうおそれのある分子層に非常に近接して、EGLの深い領域に位置している。マイクロダイセクションは、したがって、隣接する組織中の混入細胞が含まれておりませんことを確認し、保存的に行われる必要があります。ここで説明顕微解剖技術の主な利点は、furtheのために培養することができる生細胞を得る能力であるr個の実験。このため、この手順の間、全ての工程が迅速に行われることが重要であり、その組織は、できるだけ氷上に維持する。また、すべての機器·試薬は無菌でなければならない。この手順に従うと、細胞死と細胞培養の汚染を減らすことができます。また、アガロースブ​​ロック当たり取り付け複数小脳を処置時間を減らすのに役立ちます。

この技術は、のNEPの単離に限定されず、白質の分子層及び神経幹細胞からグリア細胞のような小脳の他の領域から細胞を収集するために使用することができる。小脳の横に、マイクロダイセクションは、例えば、海馬として認識領域を含む他の組織とともに使用することができる。蛍光トランスジーンの使用は、ここで利用されるよう、境界線を作成するのを助けるか、解剖用の領域を同定、容易に識別できる領域を欠いている組織において特に有用であることができ、そうでなければmとすることはできないであろうことができicrodissected。従って、この技術は研究分野と幅広い用途での細胞の精製を助ける可能性がある。