Progenitores que expressam nestina são uma população recentemente identificada de progenitores neuronais no cerebelo em desenvolvimento. Usando a técnica de microdissecção aqui apresentados em combinação com separação de células activada por fluorescência, esta população de células pode ser purificado sem contaminação de outras regiões do cerebelo e podem ser cultivadas para estudos posteriores.
Microdissecção é uma nova técnica que pode isolar regiões específicas de um tecido e eliminar a contaminação a partir de fontes celulares em áreas adjacentes. Este método foi utilizado pela primeira vez no estudo de nestina expressa progenitoras (NEPs), uma população de células recentemente identificados na camada germinal externa cerebelar (EGL). Usando microdissecção em combinação com separação de células activada por fluorescência (FACS), uma população pura de NEPs foi recolhido separadamente, a partir de precursores neuronais dos grânulos convencionais na EGL e de outros contaminantes células que expressam nestina-no cerebelo. Sem microdissecção, análises funcionais de NEPs não teria sido possível com os atuais métodos disponíveis, tais como a centrifugação em gradiente de Percoll e captura a laser microdissecção. Esta técnica também pode ser aplicado para utilização com vários tecidos que contêm tanto regiões conhecidas ou células marcadas fluorescentemente. Mais importante ainda, uma grande vantagem do presente microdissection técnica é que as células isoladas são de vida e pode ser cultivado para experimentação posterior, o que não é actualmente possível com os outros métodos descritos.
O cerebelo é composta de várias camadas de células, cada uma contendo tipos celulares distintas. Durante o desenvolvimento, a EGL contém proliferando grânulos dos neurônios precursores (PNB), enquanto a camada molecular e camada de Purkinje conter Bergmann glia e neurônios de Purkinje, respectivamente. Profundamente dentro do cerebelo encontra-se a substância branca, que contém células-tronco neurais (NCCC) e oligodendrócitos 1.
Sonic hedgehog (Shh) desempenha um papel fundamental na regulação do desenvolvimento do cerebelo e, em particular, que promove a proliferação de PNB através da ligação ao seu receptor de Patched (Ptc), um regulador negativo da sinalização Shh 2-4. A ativação anormal de sinalização Shh gera meduloblastoma (MB), o tumor cerebral maligno mais comum em crianças 5,6.
PTC MB mutantes modelos transgênicos são ferramentas poderosas para o estudo da MB e desenvolver tumores que lembram MB humano 7,8. Usando estesratos, foi descoberto que PNB são a célula de origem para hedgehog de tipo MB 7. Além disso, em adição ao PNB, que recentemente identificada uma população única de células progenitoras neuronais dentro da EGL do cerebelo em desenvolvimento, que também pode dar origem a MB. Estas células expressam níveis elevados da proteína de tipo VI filamento intermediário, nestina, e são denominados NEPs 9. NEPs estão localizados na parte profunda da EGL existir transitoriamente e apenas durante o desenvolvimento do cerebelo neonatal. Eles estão comprometidos com a linhagem de células granulares como PNB, mas são distintos como eles estão quietos e não expressam Math1, um marcador bem estabelecido para PNB convencionais 10. Além disso, NEPs dar origem a MB de forma mais eficiente do que o PNB após a ativação da via de sinalização Shh 9, que lhes uma nova origem para MB tumorigenesis faz.
Nós NEPs da EGL cerebelar previamente isolada no dia pós-natal 4 (P4) pela técnica de microdissecçãodescrito aqui 9. Microdissecção visualização microscópica directa através do tecido permite a dissecção específica da EGL cerebelar. Isto é necessário porque Nestin também é expressa por NSC na substância branca do cerebelo e por Bergmann glia na camada molecular 1,7,11,12 e era crucial que estas células não ser incluídos, como eles iriam confundir análise. As células isoladas a partir de tecido microdissecados pode ser imediatamente utilizado para a análise molecular, ou podem ser cultivadas para outras aplicações.
Para ajudar na especificamente microdissecting a EGL e para purificar ainda mais NEPs, ratos Math1-GFP (proteína fluorescente verde) foram cruzados com camundongos Nestin-CFP (proteína fluorescente ciano). O factor de transcrição de Math1 é especificamente expresso por PNB e expressão da GFP é claramente visível na EGL 9,13. Ratinhos nestina-PCP expressar uma forma nuclear de PCP e podem ser facilmente visualizadas na camada molecular 9,14. Juntos, GFP e expressão PCP criar limites para microdissecção do EGL (ver Figura 1). NEPs PCP-positivos foram então isolados por FACS, após dissociação enzimática das GECV dissecados.
Actualmente, o método mais bem utilizados para isolar células da EGL é centrifugação em gradiente de Percoll de tecido cerebelar toda 15,16. Este método, no entanto, não é capaz de excluir completamente populações celulares nestina + a partir da camada molecular e da matéria branca e, portanto, não pode ser usado para o estudo de NEPs. Microdissecção captura a laser, que utiliza a transferência de energia laser para remover as células de interesse, é outro método usado para isolar células específicas dentro de um tecido heterogéneo 17,18 mas apenas células capturadas podem ser usadas para a recuperação de ADN, ARN e proteína e não está capazes de ser cultivadas.
Este protocolo fornece uma maneira de isolar especificamente um puro população vivo, de NEPs da EGL.Esta técnica também pode ser aplicado para diferentes tipos de tecidos que tenham ou arquitectura anatómica reconhecível ou marcados com fluorescência células / regiões. Por conseguinte, a principal vantagem de incorporar esta técnica microdissecção novo em protocolos de isolamento de células é que as células podem ser isoladas a partir de regiões específicas do tecido para eliminar os contaminantes de tecidos vizinhos e as células podem ser recolhidas para análise imediatamente ou cultivadas durante outras aplicações.
O método descrito aqui é microdissecção o primeiro procedimento capaz de isolar uma população pura de células vivas para utilização em análises moleculares e funcionais. Como demonstrado por Li et al. 9, NEPs obtidos por este método podem ser cultivadas e retomado em diferentes experiências e por causa do seu elevado grau de pureza, pode também ser utilizado para a análise de microarray.
É muito importante ter tempo para se tornar proficientes co…
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostariam de agradecer a James Oesterling para citometria de fluxo assistência. Esta pesquisa foi suportada por uma concessão do Instituto Nacional do Câncer (R01-CA178380, ZY) e uma bolsa de US National Institutes de Pós-Doutorado formação (5T32CA009035-37, Lwy).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
PDL | Millipore | A-003-E | |
ultra pure low melting temperature agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
DPBS | Gibco | 14190144 |