Hier wird ein Verfahren für die Festlegung der systemischen Infektion in der neonatalen Ratten mit Kulturen von Escherichia coli K1 beschrieben. Diese nichtinvasive Vorgehensweise erlaubt Besiedlung des Magen-Darm-Trakt, die Translokation des Erregers in den systemischen Kreislauf, und das Eindringen des zentralen Nervensystems in den Plexus choroideus.
Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Wirtstier und bakterielle Erreger ist nur dann sinnvoll, wenn die Infektionsmodell verwendet repliziert die wesentlichen Merkmale des natürlichen Infektion. Dieses Protokoll beschreibt Verfahren für die Festlegung und Bewertung der systemischen Infektion aufgrund neuropathogenic Escherichia coli K1 in der neonatalen Ratten. Colonization des Gastrointestinaltraktes eine Verbreitung des Erregers entlang der gut-Lymph-Blut-Hirn-Verlauf der Infektion und das Modell zeigt starke Altersabhängigkeit. Ein Stamm von E. coli O18: K1 mit erhöhter Virulenz für den neugeborenen Ratten produziert außergewöhnlich hohen Raten der Kolonisation, Translokation in den Blutabteil und Invasion der Hirnhäute folgenden, durch das Adergeflecht. Wie in dem menschlichen Wirt, wird das Eindringen des zentralen Nervensystems durch lokale Entzündung und einer fest Letalausgang begleitet. Das Modell ist aus bewährten Werkzeug für Studien des Mechanismusder Pathogenese, für die Bewertung der therapeutischen Interventionen und für die Beurteilung der bakteriellen Virulenz.
Systemischen bakteriellen Infektionen sind eine große Bedrohung für das Wohlergehen und das Überleben des Neugeborenen; Frühgeborene sind besonders gefährdet. Neonatalen bakteriellen Meningitis (NBM), häufig mit bakterieller Sepsis, weiterhin eine signifikante Quelle von Mortalität und Morbidität in den ersten Lebenswochen und das Problem wird durch die ständige Weiterentwicklung der Beständigkeit gegen Frontantibakterielle Medikamente 1,2 verstärkt. Ein Fall von NBM ist ein medizinischer Notfall, der eine hohe medizinische, soziale und wirtschaftliche Belastung 3 trägt; Folglich besteht ein dringender Bedarf für neue Therapeutika und insbesondere neuartige prophylaktische Strategien, um die Last der Infektion. Einige Features von NBM sind ungewöhnlich: in der entwickelten Welt, sind Escherichia coli und Streptokokken der Gruppe B für die große Mehrzahl der Fälle und der Fähigkeit dieser Stämme zu NBM entlocken verantwortlich ist fast immer mit der Gegenwart eines Schutz Polysaccharid ca zugeordnetpsule dass der Erreger ermöglicht, Immunerkennung entziehen Prozesse 4. Ein sehr hoher Anteil (80 – 85%) der neuroinvasive E. coli exprimieren das K1-Kapsel 5,6, eine α-2,8-verknüpfte Poly-Sialinsäure-Polymer, das strukturell identisch mit Modulatoren der neuronalen Plastizität 7 Host ist.
Die Bewertung neuer Therapeutika und Prophylaxe für NBM und zugehörige Bakteriämie und Sepsis würde klar von einer robusten Tiermodell der Infektion, die die wichtigsten Merkmale der Krankheit im menschlichen Neugeborenen nachahmt, insbesondere die starke Altersabhängigkeit und dem natürlichen Weg der Infektion profitieren . Eine breite Palette von Modellen für Gram-positive und Gram-negative bakterielle Meningitis stehen 8,9 und diese haben unser Wissen über Pathogenese, Pathophysiologie und Behandlungsmöglichkeiten in dieser Infektionen erheblich erweitert. So experimentellen Infektionen bei Ratten, Mäuse, Kaninchen und Affen wurden verwendet, um Meningitis sowohl in der n studiereneonate und die Erwachsenen. Allerdings sind viele dieser Modelle verwenden direkte intracisternal oder subkutane Injektion von Bakterien für die Initiation der Infektion, eine künstliche Pathogenese durch Umgehen natürlichen Prozesse der Verbreitung von der Stelle der Kolonisation. In einigen Fällen sind diese Methoden der Inokulation führte zu signifikanten Veränderungen in der Pathologie; beispielsweise subkutaner Verabreichung von E. coli K1-Stämme hob die Altersabhängigkeit mit der natürlichen Infektion assoziiert, Herstellung Bakteriämie und Invasion des zentralen Nervensystems (ZNS) in beiden Neugeborenen und Erwachsenen 10. Prädisposition für E. coli NBM hängt entscheidend vertikale Übertragung des Erregers von der Mutter auf das Kind bei oder kurz nach der Geburt 11. Maternale E. coli K1 Bakterien besiedeln den Neugeborenen gastrointestinale (GI-Trakt) 11-13, die steril bei der Geburt ist, aber schnell erwirbt einen komplexen Mikrobiota 14. In kolonisierten Neugeborenen, E. coliK1 Bakterien haben die Fähigkeit, aus dem Darmlumen in den Blutkreislauf vor Eintritt in das CNS durch die Blut-Hirn- oder Blut-Liquor-Schranken 9,15 translozieren. Das Design der robusten Modelle der experimentellen Infektion sollte diese Details zu berücksichtigen.
Obwohl Mäuse wurden weit verbreitet für die Untersuchung von einigen Formen der bakteriellen Meningitis 8 verwendet werden, sind sie für die Untersuchung der neonatalen Infektionen geeignet, sie werden durch eine systemische Infektion überwältigt und nicht die starken Altersabhängigkeitscharakteristik des menschlichen Säuglingen 16 zeigen. Ferner α-Defensine, Schlüssel Peptide der GI-Trakt Schutz gegen systemische Invasion durch E. coli K1 17 sind stark in Paneth-Zellen und Neutrophile in Menschen und Ratten, aber nicht in Mäusen 18 ausgedrückt. Es ist ein bemerkenswertes Maß an Überschneidungen, Redundanz und Heterogenität in der Maus Defensin und verwandte cryptidin Gene nicht in anderen eine gefundenimals 19. Die neugeborenen Ratten wurde ursprünglich von Moxon 20 verwendet und Mitarbeiter, um die Pathogenese der Haemophilus influenzae Meningitis folgenden intranasale Impfung zu untersuchen, die Replikation der natürlichen Standort der Kolonisation dieser neonatalen Krankheitserreger im menschlichen, und anschließend für altersabhängige E. angepasst coli K1 Bakteriämie und Meningitis. Bortolussi et al. 21 Arbeitnehmer intraperitoneale Injektion des bakteriellen Inokulums auf eine Infektion auszulösen, aber der Schlüsselstudie von Glode und Mitarbeiter 22 verwendete orale Magen Fütterung, um die natürlichen Infektionsweg nach GI Kolonisierung parallel. Da die Magensonde kann Schleimhautoberflächen beschädigen, wurde das Verfahren verfeinert werden, um Zufuhr des Inokulums in den Neugeborenen 23 umfassen. Hier wird das Verfahren zum Gastrointestinaltrakt Kolonisierung und Verfahren zum Verfolgen der Infektion in anfälligen jungen Ratten beschrieben; zusätzlich werden therapeutische und präventive Anwendungen des Modells diskutiert.
Die hier beschriebene Tiermodell baut auf früheren Arbeiten, die auf die hervorstechenden Merkmale von natürlich vorkommenden Infektionen beim Menschen reproduzieren sollen. Neugeborenen Ratten wurden zunächst eingesetzt, um das Kinder Meningitis aufgrund H. studieren influenzae Typ b als die Art erfüllt die wichtigsten Kriterien für ein robustes Modell der Infektion. Somit sollte der Eintrittspforte des betreffenden Krankheitserregers der des natürlichen menschlichen Infektion reflektieren und reproduzierbar führen zu ähnlichen Pathologie von ausreichender Dauer, um für eine therapeutische Intervention zu ermöglichen. Die Techniken verwendet werden, nicht die Anwendbarkeit des Verfahrens begrenzt und sollte nicht auf den Krankheitsverlauf 20 bei. Das Modell von H. influenzae Meningitis bei Säugling Ratten durch Moxon und Kollegen entwickelten entspricht diesen Kriterien 20; die natürliche Infektion tritt nach der Kolonisierung der Schleimhäute der oberen Atemwege und dieses wichtige Merkmal wurde in Rattenjungen durch nicht-Trauma replizierttic Instillation der Bakterien auf die Membranen der Nasengänge. Wichtig ist, dass die altersabhängige Natur der Infektion im Modell nachgebildet.
Die gleiche Gruppe waren auch die ersten, um eine nicht-invasive Modell von E. entwickeln coli K1 NBM in der neonatalen Ratten-22. Pathogen-freie Sprague-Dawley-Jungtiere wurden durch Zuführen 10. AUGUST – 10. Oktober Bakterien durch eine Magensonde oral kolonisiert; Das Inokulum wurde daher erheblich höher als die von uns eingesetzten. Besiedlung mit den drei K1-Stämmen untersucht, C94 (O7: K1: H-), EC3 (O1: K1: H-) und LH (O75: K1: H3), trat bei einem relativ hohen Anteil (48-74%) des K1-gefütterten Tieren, aber Fälle von Bakteriämie, Meningitis und Mortalität waren variabel und deutlich niedriger als Raten von Kolonisation. Die klonale Natur E. coli K1 experimentelle Infektion wurde später 23 hergestellt, und es ist nun ersichtlich, dass nur O18: K1 und, in geringerem Maße, O7: K1 sind Serotypen Lagekonsequent verursachen systemische Infektion. Aus diesem Grund wird dieser Untersuchungen der Pathogenese neuropathogenic E. K1-Stamm A192PP: coli K1 wurden auf die Verwendung der Virulenz verstärkte O18 basiert. Ein Vergleich des E. coli K1 Zuführung von neugeborenen Ratten durch eine Magensonde, wie Glode und Kollegen 22 und einer Tröpfchenzufuhrverfahren der Todesfälle mit der früheren Methode, nahezu sicher auf Schäden verwendet werden, wie durch Achtman Gruppe 23 verwendet ergab eine übermäßige Anzahl an Oberflächen von mukosalen Magensonde. Da die Sätze der Kolonisierung sind vergleichbar mit diesen zwei Verfahren ist es empfehlenswert, die weniger invasive Verfahren zum Zuführen der Bakterien mit einer Pipette mit einer sterilen Spitze zu verwenden, wie in dieser Mitteilung beschriebenen.
E. coli-Stamm A192PP in unseren Studien verwendete O18: K1. Es ist ein virulenter Derivat der klinischen Stamm E. coli A192, die ursprünglich von einem Patienten mit Septikämie 27 gewonnen wurde </sup>. Die erhöhte Virulenz des Stammes wurde durch serielle Passage durch neugeborenen Ratten 26 erhalten. Der Stamm löst eine altersabhängige Krankheitsschwere, mit 100% Bakteriämie und Mortalität bei bis 2 Tage alten Tieren 28 verabreicht. Im Gegensatz dazu gibt 9 Tage alten Tieren vollständig resistent gegen Krankheiten. K1-spezifische lytische Bakteriophagen verwendet, um E. differenzieren coli K1 aus anderen E. coli-Stämme 29. In dieser Studie sollte die Anfälligkeit der lebensfähigen Bakterien Bakteriophagen K1E um (i) verwendet werden überprüfen die Reinheit des E. coli K1 Suspensionen hergestellt, die den Tieren zugeführt werden, und (ii) unterscheiden, um E. coli K1 aus anderen Coliformen, um die Lebensfähigkeit in perianalen Tupfer, Blut- und Gewebeproben zu berechnen. Wenn die Kolonie E. coli K1, werden sie anfällig für Bakteriophagen K1E Lyse sein und Bakterienwachstum wird an der Stelle des Bakteriophagen Impfung verhindert werden. Wenn die Kolonie nicht E. coli K1, wird be beständig KIE Bakteriophagen Lyse, und es sollte ein Bereich des Bakterienwachstums an der Stelle der Inokulation Bakteriophagen sein. Es sollte bedacht werden, dass Tiermodelle können alle Funktionen des natürlich vorkommenden Krankheit nicht reflektieren. Das aktuelle Modell kann modifiziert werden, um die Virulenz Merkmale anderer als E. neuropathogenic Bakterien untersuchen coli A192PP und Variationen in der Größe der Kolonisierung Inokulum untergebracht werden können. Zukünftige Anwendungen der Technik könnten die Bewertung von dringend benötigten Medikamenten, um den Zustand zu behandeln und um Details der Wirtsantwort auf Kolonisation und Gewebeinvasion aufzudecken.
Die hier beschriebene Methode ist einfach, aber effektiv. Einzel Würfe von 10-12 Welpen wurden als Test- oder Kontrollgruppen eingesetzt und dies innerhalb-Wurf Ansatz gewährleistet ein hohes Maß an Reproduzierbarkeit und statistische Gültigkeit. Es ist zwingend notwendig, dass die Welpen in ihre natürliche Mütter so schnell wie möglich nach jeder procedur zurücke und Würfe sollten daher nicht enthalten Tiere unterziehen verschiedene Interventionen. Es ist wichtig, dass die Fed Inokulum erwärmt sonst die Welpen werden die angebotenen Kultur abzulehnen. Die Welpen entwickeln sich schnell eine komplexe Mikrobiota und innerhalb von zwei Tagen nach der Geburt der GI-Trakt ist mit einer breiten Palette von Bakterien aus der als der am häufigsten vorkommenden Mikroben in der Säuglings- und Erwachsenen gut etablierten Stämme besiedelt. Pups, die nicht E. zugeführt haben coli A192PP nicht E. tragen coli K1 im GI-Trakt 17 und damit Bestimmung der Raten der Besiedlung ist relativ einfach. Jedoch basierte die neuS qPCR Verfahren zum Nachweis von E. kolonisierenden coli K1 ist viel empfindlicher, dass die traditionellen Kulturverfahren und wird dringend empfohlen 17.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde durch Forschungsstipendien G0400268 und MR / K018396 / 1 von der Medical Research Council unterstützt und durch Aktions Medizinische Forschung. Weitere Unterstützung wurde von der National Institute for Health Research University College London Hospitals Biomedizinische Forschungszentrum zur Verfügung gestellt.
Pathogen-free Wistar rats (12 x neonate, 1 x lactating mother) | Harlan, UK | www.harlan.com | |
E. coli K1 A192PP | Taylor lab | www.ucl.ac.uk | Mushtaq et al. 2004 |
Bacteriophage K1E | Taylor lab | www.ucl.ac.uk | Mushtaq et al. 2004 |
Glycerol | Sigma, UK | www.sigmaaldrich.com | G5516 |
Mueller-Hinton Agar | Oxoid, UK | www.oxoid.com | CM0337 |
Mueller-Hinton Broth | Oxoid, UK | www.oxoid.com | CM0405 |
MacConkey Agar | Oxoid, UK | www.oxoid.com | CM0007 |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma, UK | www.sigmaaldrich.com | P4417 |
Ethanol 100% | Sigma, UK | www.sigmaaldrich.com | E7023 |
Heparin Sodium Salt | Sigma, UK | www.sigmaaldrich.com | 84020 Prepare 20-50 units/ml |
RNAlater Solution | Sigma, UK | www.sigmaaldrich.com | R0901 10µl/mg tissue |
Acetic Acid | Sigma, UK | www.sigmaaldrich.com | 320099 |
Chloroform | Sigma, UK | www.sigmaaldrich.com | C2432 |
Methanol | Sigma, UK | www.sigmaaldrich.com | 322415 |
Cotton-tipped swabs | Fisher Scientific, UK | www.fisher.co.uk | 11542483 |
Alcotip Swabs | Scientific Laboratory Supplies, UK | www.scientificlabs.co.uk | SWA1000 |
Petri dishes | Sigma, UK | www.sigmaaldrich.com | P5856 |
30mL Universal Tube | AlphaLaboratories, UK | www.alphalabs.co.uk | CW3890 |
0.5ml microcentrifuge tubes | StarLab, UK | www.starlab.co.uk | I1405-1500 |
1.5ml microcentrifuge tubes | StarLab, UK | www.starlab.co.uk | I1415-1000 |
0.1µl calibrated loops | StarLab, UK | www.starlab.co.uk | E1412-0112 |
L-shaped spreaders | StarLab, UK | www.starlab.co.uk | E1412-1005 |
Cuvettes | Fisher Scientific, UK | www.fisher.co.uk | 10594175 |
Forceps straight with fine points | Fisher Scientific, UK | www.fisher.co.uk | 12780036 |
Forceps straight with blunt tips | Fisher Scientific, UK | www.fisher.co.uk | 12391369 |
Forceps watchmaker's curved with very fine points | Fisher Scientific, UK | www.fisher.co.uk | 12740926 |
Scissors straight with very fine points | Fisher Scientific, UK | www.fisher.co.uk | 12972055 |
Laboratory Scissors | VWR, UK | www.vwr.com | USBE4251 |
25g Syringe Needles | Greiner Bio-One Ltd | www.greinerbioone.com | N2525 |
LAMBDA 25 UV/Vis Spectrophotometers | PerkinElmer, UK | www.perkinelmer.co.uk | L60000BB |
Unitemp Incubator | B&T, UK | OP958 | |
Multitron shaking incubator | INFORS HT, UK | www.infors-ht.com | AJ118 |
Ultra-Turrax T-10 homogenizer | IKA Werke | www.ika.com | 0003737000 |