שיטה זו יוצרת סביבה מוחשית, מוכרת לעכבר כדי לנווט ולחקור במהלך הקלטות מיקרוסקופיות הדמיה או תא בודד אלקטרו, אשר דורשות קיבוע איתן של ראשו של בעל החיים.
זה נרחב הודה כי השימוש בהרדמה כללית יכול לערער את הרלוונטיות של נתונים אלקטרו או Microscopical המתקבלים מהמוח של חית חיים. יתר על כן, ההחלמה הממושכת מהרדמה מגבילה את התדירות של פרקים להקלטה / הדמיה חוזרות ונשנות במחקרים ארוכי טווח. לפיכך, שיטות חדשות שתאפשר הקלטות יציבים מעכברים מתנהגים לא הרדים צפויות לקדם את תחומי מדעי המוח סלולריים וקוגניטיביות. פתרונות קיימים נעים בין עצם ריסון פיזי לגישות מתוחכמות יותר, כגון הליכונים ליניארי וכדוריים המשמשים בשילוב עם מציאות וירטואלית ממוחשבת. הנה, שיטה חדשה מתוארת בי עכבר קבוע בראש יכול להסתובב homecage הנייד הרים את האוויר ולחקור את סביבתו בתנאים ללא מתח. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לבצע בדיקות התנהגותיות (למשל, למידה, התרגלות או זיהוי אובייקט רומן) בו זמנית עםשני פוטונים הדמיה מיקרוסקופית ו / או הקלטות תיקון מהדק, כל שילוב בניסוי יחיד. וידאו מאמר זה מתאר את השימוש במכשיר ער קיבוע ראש החיה (homecage הנייד), מדגים את הנהלים של התרגלות לבעלי חיים, ומדגים מספר היישומים האפשריים של השיטה.
מגמה האחרונה מרגשת בתחום מדעי המוח היא לפתח גישות ניסיוניות למולקולריים ותאי חיטוט של רשתות עצביות במוח של ער, מתנהג מכרסמים. גישות כאלה מחזיקות מבטיחות לשפוך אור חדש על תהליכים נוירופיזיולוגיים העומדים בבסיס תפקוד מוטורי, אינטגרציה חושית, תפיסה, למידה, זיכרון, כמו גם התקדמות פציעה, ניוון מוחיים ומחלות גנטיות. יתר על כן, הקלטה מהמוח של החיה ערה טומנת בחובו הבטחה בפיתוח של סוכנים טיפוליים חדשניים וטיפולים.
קיימת מודעות הולכת וגדלה כי הרדמה, אשר שימוש בו נפוצות בניסויים נוירופיזיולוגיות, יכולה להשפיע על המנגנונים הבסיסיים של תפקוד המוח, שעלול להוביל לפרשנות מוטעה של ממצאים ניסיוניים. לפיכך, קטמין ההרדמה בשימוש נרחב במהירות מגביר היווצרות של קוצים הדנדריטים חדשים ומשפר את התפקוד הסינפטי 1; עוד anesthet נפוץisoflurane ic ברמות הרדמה כירורגית מדכא לחלוטין את פעילות בקליפת המוח ספונטנית אצל חולדות שזה עתה נולד ותנודות-פרץ ציר לוקים בבעלי חיים מבוגרים 2. נכון לעכשיו, רק מספר מוגבל של גישות לאפשר ניסויים בעכברים שאינם מורדמים באמצעות הדמיה מיקרוסקופית שני פוטונים או הקלטות תיקון מהדק. ניתן לחלק את הגישות אלה להכנות באופן חופשי מרגשות וקבוע בראש.
האטרקטיביות הייחודית של הכנת בעלי חיים לנוע בחופשיות היא שהיא מאפשרת הערכה של התנהגות טבעית, כולל תנועות גוף כולו במהלך ניווט. דרך אחת לתמונה בתוך המוח של מכרסם לנוע בחופשיות היא לצרף מיקרוסקופ רכוב ראש מיניאטורי או fiberscope 3-5. עם זאת, מכשירים ממוזערים נוטים להיות בעלי ביצועים אופטיים מוגבלים בהשוואה לשני פוטונים במיקרוסקופ המבוסס על מטרה, ולא ניתן לשלב בקלות עם הקלטות תא התיקון-clamp כל 6.
Exiפתרונות עוקץ לתיקון ראש מכרסם ערה הסתמכו בעיקר גם על ריסון פיזי 7,8 או בהכשרת בעלי החיים להפגין איפוק ראש מרצון 9. גישה פופולרית נוספת היא לאפשר לאיברים של בעלי החיים לנוע על ידי הצבתו ב, למשל, הליכון כדורי 10; גישה זו לעתים קרובות בשילוב עם מציאות וירטואלית ממוחשבת. ניסויים אלקטרו על עכברים קבוע בראש שמשמשים בעיקר הקלטות תאיים ושמשו ללמוד רגולציה מרכזית של תפקוד לב וכלי דם 11, השפעות של הרדמה על פעילות עצבית 12, התגובה השמיעתית בגזע המוח 13 ועיבוד מידע 14. הקלטות החלוצים תאיים / כל התא בבעלי חיים מתנהגים ער בוצעו ב2000s והתמקדו בפעילות עצבית הקשורים לתפיסה והתנועה 15-20. בערך באותו הזמן, מחקרי הדמיה המיקרוסקופיים הראשונים על עכברים ער היו פאבראיתי אור, שבו שני פוטונים במיקרוסקופ שימש בקליפה המוטורית של חולדות מאופקות פיזי 7 ועל עכברים רצים על הליכון כדורי 21.
מחקרי מיקרוסקופיה ואלקטרופיזיולוגיה לאחר in vivo הראו כי הכנת קיבוע הראש יכולה להיות משולבת בהצלחה עם פרדיגמות התנהגותי המבוססות על תנועות forelimb, זיהוי ריח, ומעיף, ומלקקים את 8,22-25. עכברים שהונחו על הליכון הכדורי יכולים להיות מאומנים כדי לנווט בסביבה החזותית הווירטואלית שנוצרה על ידי מחשב 10,26. הקלטות תאי / תאיים, הוכיחו כי, בבעלי חיים קבועים בראש ניווט סביבה וירטואלית כגון, הפעלה של תאים בהיפוקמפוס מקום ניתן לאתרם 27. בסביבה חזותית וירטואלית, עכברים להפגין קצב תטא נורמלי הקשורים לתנועה בפוטנציאל המקומי השדה ונקיפת תטא השלב במהלך תנועה פעילה 27. לאחרונה, activit המרחב ובזמןדפוסי y של אוכלוסיות נוירונים נרשמו אופטי בעכברים במהלך העבודה משימות החלטת זיכרון בסביבה וירטואלית 28.
למרות שאפשר פריצת דרך במחקר, יש לו את עיצוב הליכון הכדורי כמה מגבלות מובנות. ראשית, נדרש בעלי החיים לנוע על פני השטח בלתי מוגבל של כדור הרים באוויר מסתובב, שאינו מהווה מכשולים מוחשיים, כגון קירות או מחסומים. הגבלה זו היא רק בחלק פיצוי "המציאות מדומה" המחשב שנוצר, כי קלט חזותי הוא לטעון פחות יעיל בעכברים וחולדות בהשוואה לקלט החושי המישוש (למשל, זיף בנגיעה או ללקק), שמינים אלה באופן טבעי לסמוך הלאה. שנית, העקמומיות הניכרת של פני השטח הכדור עשויה להיות לא נוחה לעכברי מעבדה המשמשים להליכה על רצפה שטוחה בכלובים שלהם. לבסוף, בקוטר העצום של הכדור (לפחות 200 מ"מ לעכברים ו300 מ"מ לחולדות) הופך את הגודל האנכי של כדורימכשיר הליכון גדול יחסית. זה עושה את זה קשה לשלב הליכון כדורי עם רוב setups מיקרוסקופיה זמין מסחרי, ולעתים קרובות דורש בניית התקנה חדשה סביב הליכון באמצעות מסגרות מיקרוסקופ בהזמנה אישית.
הנה, שיטה חדשה מתוארת בי עכבר קבוע בראש יכול להסתובב homecage הנייד הרים את האוויר שכוללת רצפה שטוחה וקירות מוחשיים, ולחקור את הסביבה הפיסית בתנאים ללא מתח. מאמר זה מדגים את הנהלים של אימוני עכבר וקיבוע הראש, ומספק דוגמאות מייצגות שבו הקלטות של שני פוטונים במיקרוסקופ, דימות אופטי פנימי ותיקון-clamp מבוצעות במוח של עכברים מתנהגים ער.
כדי להבין את הפיסיולוגיה של המוח והפתולוגיה טוב יותר, מחקר חייב להתבצע במגוון רחב של רמות מורכבות הכנה, תוך ניצול הטכניקות המתאימות ביותר עבור כל הכנה. כיום, מגוון רחב של מתודולוגיות מדעי המוח (מגוף מלא fMRI למיקרוסקופיה STED תת אברון) מיושם בקלות לבעלי חיים מורדמים, ואילו ניסויים בבעלי חיים ער ומתנהגים ייצגו אתגר מתודולוגיים משמעותי.
כאן, גישה חדשנית מתוארת בי בעלי חיים במעבדה, למרות היותו בחוזקה בראש קבוע, יכולים לנוע homecage הנייד הרים את האוויר ולחקור את סביבתה המוחשית בתנאים ללא מתח. הכנת בעלי החיים מתנהגים קבוע הראש המוצגת כאן מספקת מספר היתרונות חשובים. ראשית, נתונים אלקטרו או הדמיה המתקבלים בשיטה זו הם ללא פשרות לא על ידי הרדמה ולא על ידי לחץ-Induced אילוץ. מיקום של העכבר לביתו הניידכלוב הוא מהיר ואינו דורש הרדמה של בעלי החיים אפילו transiently. שנית, homecage-הרים האוויר מבטיח יציבות מכאנית שצריך כדי לכמת שינויים במורפולוגיה עצבית עדינה ולהקליט פעילות אלקטרו תא בודד בחיות ערה. לבסוף, העיצוב של homecage הנייד קומפקטי יותר בהשוואה להליכון הכדורי, ובכך מאפשר מיצוב homecage הנייד תחת מיקרוסקופ הזקוף סטנדרטי עבור הדמיה שני פוטונים או הקלטת התיקון-clamp במוחו של העכבר ער.
קיבוע ראש המשרד בhomecage הנייד דורש השתלה של בעל מתכת ארבע כנפיים שתוכנן במיוחד, עם פתח עגול במרכז לגישה אופטית או חשמלית לאזור במוח המשמש כבסיס. מחזיקי מתכת אלה מחוברים לגולגולת באמצעות שילוב של דבק, מלט שיניים וברגים קטנים מוברגים לתוך עצם הגולגולת. הליך כירורגים זה פותח על בסיס מספר גדול של העברפורסם נהלים, ונמצא לגרום לחלון הכנת גולגולת יציבה ושחזור. לin vivo ניסויי אלקטרו, חלון בצורת ירח 34, פתיחת גולגולת קטנה בגודל (פחות מ 0.5 מ"מ) 32, והכנה מכוסה זכוכית קדחה 35 כבר נוצל. הנה, החלון גולגולתי "ההפוך" היה מושתל עם או (בקוטר 3.5 מ"מ) גדול או פתיחת גולגולת קטנה (פחות מ 0.5 מ"מ קוטר). צמצום תנועה במוח הוא קריטי להקלטות תא בודדות יציבים, ולכן מומלץ לבצע craniotomies גודל הקטן לניסויי אלקטרו. לאחר ההשתלה של החלון גולגולתי לניסויי הדמיה אופטית, בעלי החיים מותר לשחזר לפחות 2 או 3 שבועות, ובתקופה זו החלון הראשון transiently מאבד את שקיפותה ולאחר מכן חוזר בו (עם תשואת 50-70%, בהתאם הרקע הגנטי של זן העכבר). שקיפות של החלון וstabil הגולגולתity של "הכובע" של הדבק דנטלי המחובר לגולגולת ניתן לאמת באמצעות מיקרוסקופ רגיל משקפת ובדיקה גופנית בזמן טיפול בבעלי חיים. בסוף תקופת ההחלמה 2-3 בשבוע, אותם בעלי חיים שמפגינים כל סימנים של דלקת שלאחר תפעולית שייר או ליקויים מכאניים במלט השיניים צריכים להיות מחוץ הניסויים והופסקו.
הגיל האופטימלי להתחלת אימוני העכברים הוא 2-4 חודשים (המקביל למשקל הגוף של 20-40 גר '). בבעלי חיים צעירים, עיגון של "הכובע" מלט שיניים לגולגולת יכול להיות לא אמין, שעלול להפחית את עמידותו מפני הלחץ המכני שהוטל על ידי תנועה של העכבר קבוע בראש בhomecage הנייד. למרות שעכברי זכרים ונקבה מופיעים מוכנים באותה מידה כדי לנווט בhomecage הנייד, יש נטייה כדי להשיג אחוז טוב יותר של חלונות גולגולת שהשיב את השקיפות שלהם בנקבות עכברים (מידע לא מוצג). לפיכך, לא על מנתo להבטיח תמהיל מאוזן של מינים בקבוצה של בעלי חיים שנבחרו עבור הדמיה, השתלת חלונות גולגולת בכ 30% עכברי זכרים יותר מומלץ. אינטראקציות חברתיות ידועות כדי לשפר את רווחתם של בעלי החיים ולהפחית את הלחץ, ולכן רצוי כי להמלטה הם פעלו והתאמנה במקביל והמשיכה יחד בכלובי קבוצת דיור.
בניגוד לנהלים שפורסמו להכנת הליכון הכדורית 13, שיטת ניצול homecage הנייד אינה דורשת הרדמת העכבר ברגע קיבוע הראש. הבדל זה הוא חשוב משום שהוא מאפשר כדי לשלול כל השפעה שיורית כי גם קצר ופרק הרדמה "אור" סביר להניח שתהיינה במדידות הפיזיולוגיות המתקבלות לאחר זמן קצר. ואכן, למרות שבמחקרים שבם קיבוע הראש נעשה בהרדמה והניסויים בפועל שהחלו לאחר תקופת המתנה קצרה 13, לא אחד יכוללכלול השפעות ארוכות טווח אפשריות של פרק הרדמה הקצר על נתונים הניסיוניים. מחקרים אחרים יש לסמוך על חסך מים להתרגלות שיטתית של בעלי החיים בראש הקיבעון ומשמשים גמול מים כאמצעי להנעת החיה להישאר נייח 36. עם זאת, שיטת קיבוע הראש מבוסס התגמול מגבילה את הבחירה של מבחנים התנהגותיים רלוונטיים, חשוב, תופסת אחת מעמותות תמריצים לתגמול המבוססות היטב. לעומת זאת, בשיטה של התרגלות עכבר לראש הקיבעון בhomecage הנייד אינה דורשת חסך מים וגמול שלאחר מכן.
השלמת homecage הסלולרי עם מערכת אספקת מים מומלץ לניסויים ארוכים טווח. אימונים וניסויים בבעלי חיים המוצגים כאן נעשו בשעתי יום (08:00-18:00), אשר תואם את התקופה מבחינה פיזיולוגית הפסיבית עבור אלה עכברים שנשמרים תחת סטנדרטי לוח הזמנים אור 12-HR (lights בשעת 6 בבוקר ואת בשעה 6 בערב). מאז צריכת המים קשורה באופן ישיר לפעילותו של העכבר, בעכברי תקופה פסיביים אינו דורש אספקת מים אם משך אימון / הדמיה / הקלטה אינו עולה על 2 שעות. בנוסף לעיתוי ומשך האימונים, צריך להתייחס לנושא של המספר האופטימלי של הפעלות הנדרשות להרגלת בעלי החיים לhomecage הנייד. לשם כך, שני קריטריונים המשמשים להערכת מתח המושרה על ידי נהלי ראש קיבוע: i) ירידה במשקל, וii) ברמת הפעילות של תנועה. כפי שניתן לראות באיור 6, ירידה במשקל מגיעה לרמה הממוצעת של 6% ביום אימונים 2, ומתהפכת לגמרי ביום אימונים 4 (איור 6 א). באופן עקבי עם הדינמיקה לשקול, רמת הפעילות של תנועה של בעלי חיים קבוע בראש הוא דיכא ביום הראשון של אימונים, אבל מתייצבת ביום אימונים 4 (איור 6 ד '). בהתבסס על המדידות הללו, אנו suggesלא כי המשך המינימלי של תקופת אימוני עכבר על homecage הנייד הוא 4 ימים, כפי שתואר בפרוטוקול בזאת.
שימוש ב, homecage הנייד השטוח מרוצף-הרים האוויר מאפשר הוספת משימות מורכבות (הסנסורית, תפישתית, וקוגניטיבית) לפרדיגמות אימון לעכברים שקבועים בראש. במחקר הנוכחי שני פרוטוקולים של בדיקות התנהגותיות מוצגים. שני פרוטוקולים לנצל רמזי ריח ויכולים להיות משולבים עם הדמיה / הקלטות אורך בקליפת מוח העכבר. למרות homecage הנייד מיוצר מחומרים בלתי סופגים, אחד עדיין צריכה לקחת בחשבון הפרעות אפשריות בין הריח של המכשיר וריח מבחן (ים). גורם נוסף שעלולים להפריע לרמזים חזותיים / מישוש של ניסוי התנהגותי הוא הצומת בין הקיר ולהוסיף, שאינו חלק ועשויים, אפוא, להיתפס על ידי בעלי החיים כנקודת ציון. זה שווה לשים לב כאן כי, על מנת למזער את המצוקה של בעלי החיים במהלך Inte כזהrventions כמיקום של כותנה הצגת ריח לקיר homecage הנייד, בניסויים צריכים להתאמן כדי לבצע התערבויות כאלה מהר ככל האפשר ולהימנע מטיפול ממושך בכלוב פחמן. אסטרטגיות אלטרנטיביים למצגת ריח / אובייקט רומן הן על הדעת, למשל, הצבת פתרון מבוסס הידרוג'ל טיפות או אובייקטים (כגון שבבי מזון) על גבי מדפים קטנים המחוברת למשטח הפנימי של קיר כלוב פחמן בשיא בקנה אחד עם מיצוב הראש של החיה.
homecage הנייד מאפשר לבעלי חיים קבוע בראש כדי לבצע מגוון רחב של תנועות דו ממדים הכוללים תנועה אופקית, situp, טיפוח, טאטאתי, מלקק, האף לחטט, תנועות כף קדמיות מיומנת, וקיר נוגע ללב עם forelimbs, כפי שמודגם במחקר הנוכחי . שימוש homecage נייד והפרוטוקולים שהוצגו כאן, חוקרים יכולים ללמוד את המערכת העצבית הסנסורית עם רמה גבוהה של שליטה על שניהם את מצב הגירויים וקריאת פסקי התנהגותיות. יתר על כן, מחקרים של יכולות קוגניטיביות בעכברים ער יכולים להתבצע באוויר, ניווט במרחב ובמשימות קבלת החלטות.
ישנן מספר מגבלות מעשיות של שיטה זו. ראשית, יש צורך בכמות משמעותית של אוויר בלחץ כדי להשיג את כוח הרמת homecage ולבצע ניסויים ארוכים טווח. שנית, homecage הנייד ביישום הנוכחי שלה הוא רק 18 סנטימטר קוטר, ולכן מספק מרחב קטן יחסית ופשוט בהשוואה למציאות וירטואלית, שבו סביבה ניסיונית מורכבת יכולה להיות מתוכננת ללא כל מגבלות במרחב. שלישית, במהלך גירוי זיף וניסויים מבוססי תגמול שהוצגו כאן, מכשיר היה בשימוש שמגביל את האפשרות קיר המגע לעכבר. תוספת של ערוץ חיצוני חזותי או גירוי חושי (כגון מקרן אור מכוון העין) תדרוש עיצוב מכשיר יותר ארגונומי וקומפקטי בהשוואה להפתרונות מרובה מסך או כיפת הקרנה שהיה בשימוש בניסויים הליכון הכדורי.
לסיכום, השימוש בעכברים שהקבוע בראש נעו בhomecage הנייד הרים את האוויר מאוד מקל על המחקרים המשלבים רמות תאיות, מולקולריות והתנהגותיות של התבוננות ומניפולציה בניסוי יחיד. יישומים ספציפיים המאוירים כאן כוללים שני פוטונים הדמיה מיקרוסקופית, הדמיה אות אופטי פנימית והקלטות התיקון-clamp בעכברים שאינן מתנהג בהרדמה. צפוי כי גישה זו תפתח אופקים חדשים בניסויים בעכבר ער, מתנהג ולשמש ככלי שימושי עבור שניהם פיתוח תרופות ומחקר בסיסי של תפקוד המוח.
The authors have nothing to disclose.
המחברים מודים לפרופ 'Eero Castren להערות המועילות שלו על כתב היד. העבודה נתמכת על ידי מענקים מהאקדמיה של פינלנד, המרכז לניידות בינלאומית של פינלנד, ובית הספר פיני בוגר מדעי המוח (מוח ואת נפש תכנית דוקטורט).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Tweezers Stainless Steel, 115mm | XYtronic | XY-2A-SA | |
Animal trimmer, shaving machine | Aesculap | Isis GT420 | |
Binocular Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad | Supertech | TMP-5b | |
Blunt microsurgical blade | BD | REF 374769 | |
Borosilicate tube with filament | Sutter Instruments | BF120-69-10 | For patch pipette production |
Camera | Foscam | FI8903W | Night visibility |
Carprofen | Pfizer | Rimadyl vet | |
Dental cement | DrguDent, Dentsply | REF 640 200 271 | |
Dexamethasone | FaunaPharma | Rapidexon vet | |
Disposable drills | Meisinger | HP 310104001001008 | |
Dulbeco’s PBS 10X | Sigma | D1408 | |
Dumont #5 forceps, 110 mm | FST | 91150-20 | |
Eyes-lubricant | Novartis | Viscotears | For eyes protection during operation and as viscose solution for immersion |
Foredom drill control | Foredom | FM3545 | |
Foredom micro motor handpiece | Foredom | MH-145 | |
Four-winged metal holder | Neurotar | ||
Head Holder for Mice | Narishige | SG-4N | Assembled on stereotaxic instrument |
Hemostasis Collagen Sponge | Avitene, Ultrafoam BARD | Ref 1050050 | |
Imaris | Bitplane | ||
Ketamine | Intervet | Ketaminol vet | |
Kwik-Sil | WPI | ||
Mai Tai DeepSee laser | Spectra-Physics | ||
Micro dressing forceps, 105 mm | Aesculap | BD302R | |
Microelectrode puller | Narishige | PC-10H | Vertical puller for glass pipette production |
Micromanipulator | Sensapex | ||
Mini bolt | Centrostyle | Ref. 00343 s/steel M1.0x4.5 | |
Mobile Homecage | Neurotar | ||
Multiphoton Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1000MPE | |
Nonwoven swabs 5×5 | Molnlycke Health Care | Mesoft | Surgical tampons |
Polyacrylic glue | Henkel | Loctite 401 | |
Round glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | ||
1.5 thickness | |||
Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
Student iris scissors, straight 11.5 cm | FST | 91460-11 | |
Xylazine | Bayer Health Care | Rompun vet |