杀手人工抗原提呈细胞（KaAPC）为有效<em>在体外</em>人抗原特异性T细胞耗竭

1代的HLA-A2-IG基于KaAPC的准备无菌的硼酸盐缓冲液。使硼酸在水中的0.1M的溶液，并调节pH至7.0。无菌滤器（0.22微米）缓冲液中，并在4℃下存储。 准备不育珠洗涤缓冲液。用磷酸盐缓冲盐水（PBS），而镁和钙。添加人AB血清的3％终浓度。为2mM的最终浓度添加乙二胺四乙酸（EDTA）。添加叠氮化钠（NAN 3）为0.01％，终浓度。无菌滤器（0.22微米）缓冲液中，并在4℃下存储。 转移250微升从库存环氧树脂珠（约100×10 6珠）进入无菌，螺杆顶端的玻璃小瓶中。 加入250μl硼酸盐缓冲液。 放在磁铁玻璃小瓶，让珠坚持2分钟;吸出缓冲液和从磁体取出玻璃小瓶中。 用1ml硼酸盐缓冲液洗一次珠子。 重悬珠到550微升0.018微克/ ml的HLA-A2-Ig和3.64微克/毫升抗人CD95单克隆抗体（克隆CH11）和通过轻轻振动混合。 （请参阅讨论部分以获取更多信息。） 孵育玻璃小瓶上的转子端部上结束时，在4℃下放置24小时。 降速珠在300×g离心2分钟。 将玻璃瓶上的磁铁2分钟，吸出“KaAPC加载解决方案”;从磁体取出玻璃小瓶中，加入1毫升珠洗涤缓冲液并通过摇动小心重悬。 重复步骤1.10的两倍。 孵育玻璃小瓶在旋转器上在4℃下放置24小时的1ml珠洗涤缓冲液。在这点上，所有的残余蛋白质结合位点会被包含在珠洗涤缓冲液中的人AB血清阻断。 降速珠在300×g离心2分钟。 广场的玻璃小瓶上的磁铁2分钟，吸珠洗涤缓冲液;从磁体取出玻璃小瓶中，并用1ml的PBS溶液更换。 2，质量控制，肽加载，W灰化，存储和KaAPC稳定性转让1.5×10 5 KaAPC成流式细胞仪管，洗用1ml FACS洗涤缓冲液。 重悬珠子于100μlFACS洗涤缓冲液中添加1μl的抗小鼠IgG1的PE（用于检测HLA-A2-Ig的Fc部分的）和1μl的抗小鼠IgM抗体FITC（克隆R6-60.2的，用于检测抗人CD95单克隆抗体）。 孵育15分钟，在4℃下，用1ml FACS缓冲液洗涤，并重新悬浮在250μl的FACS洗涤洗涤缓冲液并通过流读染色流式细胞仪。 ÂKaAPC批次制成的协议部分中所述的图1中的QC污点。染色，如在协议部分所述用抗小鼠的IgG1 PE单抗2 HLA-A2-Ig的检测，而抗人CD95 （抗Fas）用抗小鼠IgM抗体FITC单克隆抗体检测（见协议本身ction 2.2）（蓝线）。填充黑色曲线表示用抗小鼠的IgG1 PE单克隆抗体或抗 – 小鼠IgM抗体FITC单克隆抗体，分别空珠。在右上角的数字表示平均荧光强度（MFI）。 请点击这里查看该图的放大版本。 对于肽荷载传递20×10 6 KaAPC到一个新的无菌玻璃小瓶中，将上磁铁2分钟，吸出PBS重悬珠到500微升新鲜的PBS，5微克肽（记住，只有HLA-A2限制性肽会结合到二聚体！）。 店内装KaAPC在4℃下直到使用，为至少3天，以允许足够的肽装载到HLA-A2-Ig二聚体。 在使用前立即，洗净装KaAPC如1.14所表示的肽;重复此步骤，至少6倍。 注意：这是关键的一步，以确保自由肽具有吨Ø被完全删除，以避免假阳性结果被杀;残余的游离肽已经显示出诱导细胞凋亡中的抗原特异性T细胞的培养物9。为了排除可溶性肽的效果，运行肽装上清对照样品和清洗KaAPC（见3.8）。 计数使用血球珠和日期，名称和肽​​浓度的标签。 注：加载KaAPC保持功能，在4℃下至少一个月。一个月以后，重新加载具有相同的肽可以KaAPC将要用于长达一年。 3 KaAPC 体外杀灭试验制备共培养介质。制备添加有3％的T细胞生长因子及3％供体的自体血浆（在实验室6制备）的完全RPMI培养基中。如果捐助者的自体血浆不可用，用热灭活人AB血清。 准备AnnexinV结合缓冲液配制。溶解8.12克氯化钠（NaCl）和0.12克计算值鎓氯化物（ 氯化钙 ）成990毫升DDH 2 O.Add 10ml1M的HEPES缓冲液中。 产生人的抗原特异性T细胞。 （关于详细的协议，请参阅使用人工抗原提呈细胞（人工APC）先前公布7）。确保肽特异性为至少> 75％，这通过四聚体染色来确定。 对于每个样品孵育2×10 5个抗原特异性T细胞/孔（在96孔圆底板）在200μl的共培养培养基中以1：在湿润的培养箱1的比例与KaAPC 48小时，在37℃ C和5％的CO 2。 嘉实样品和转移到FACS管;洗用1ml AnnexinV结合缓冲液，离心后，在300×g离心5分钟，弃去上清，重悬在100μl的AnnexinV结合缓冲液染色样品与1μl的AnnexinV FITC和5μl的7-AAD为10-15分钟，在室温洗1毫升AnnexinV结合缓冲液;降速为300×g离心5分钟，弃去上清液的在250μLAnnexinV结合缓冲液D重悬立即读取样品的流式细胞仪。 准备下面的示例通过KaAPC确定抗原特异性杀伤：只有T细胞; T细胞+可溶性抗-CD95; T细胞+卸载KaAPC; T细胞+非同源肽加载KaAPC; T细胞+同源肽加载KaAPC; T细胞+上清同源肽加载KaAPC。 图2 KaAPC杀测定肽加载KaAPC或控制珠（HLA-A2-Ig的只有珠）进行48小时培养，在以1:1的比例与CMVpp65特异性T细胞（〜80％），收获，并随后用AnnexinV和碘化丙啶（PI），以通过流式细胞术（见协议部分3.3-3.7）确定细胞凋亡。“同源”是指小珠装入CMVpp65和“非同源”是广告装载MART-1肽。数字表明可行的T细胞在各小区的左下象限的百分比。 请点击这里查看该图的放大版本。 执行交错，实验中，产生两个不同特异性的抗原特异性T细胞。 进一步评估KaAPC的抗原特异性耗尽能力与抗原特异性消除T细胞的异质性T细胞群的同时分析。 （关于详细的协议，请参阅茨等人10）。