효율적인위한 킬러 인공 항원 제시 세포 (KaAPC)<em> 체외</em> 인간의 항원 특이 T 세포의 고갈

HLA-A2-IG 기반 KaAPC의 1 세대 멸균 붕산 버퍼를 준비합니다. 물에 붕산의 0.1 M 솔루션을 확인하고 7.0으로 pH를 조정합니다. 무균 필터 (0.22 μm의) 버퍼와 4 ° C에서 보관. 멸균 비드 세척 버퍼를 준비합니다. 마그네슘과 칼슘없이 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)를 사용합니다. 3 % 최종 농도에 대한 인간 AB 혈청을 추가합니다. 2 mM의 최종 농도에 대한 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)를 추가합니다. 0.01 % 최종 농도에 아 지드 화 나트륨 (NaN의 3)를 추가합니다. 무균 필터 (0.22 μm의) 버퍼와 4 ° C에서 보관. 멸균에 재고 에폭시 구슬 (약 100 × 10 6 구슬)의 250 μl를 전송, 최고 유리 병을 조입니다. 붕산 버퍼의 250 μl를 추가합니다. 자석에 유리 병을 넣어 구슬이 2 분 동안 부착 할 수; 흡인은 버퍼 자석에서 유리 병을 제거합니다. 1 ㎖의 붕산 버퍼로 한번 구슬을 씻으십시오. 0.018 μg의 550 μL로 재현 탁 비즈/ ㎖ HLA-A2-IG 및 3.64 μg / ml의 항 – 인간 CD95 단클론 항체 (클론 CH11) 부드럽게 흔들어 섞는다. (자세한 내용은 설명 절을 참조하십시오.) 24 시간 동안 4 ° C에서, 말을 통해 회 전자 끝에 유리 병을 품어. 2 분 동안 300 XG에 구슬을 스핀 다운. 2 분 동안 자석에 유리 병을 놓고 "KaAPC 로딩 솔루션을"대기음; 자석에서 유리 병을 제거 비드 세척 버퍼의 1 mL를 넣고 흔들어 조심스럽게 재현 탁. 단계를 반복 1.10 배. 1 ml의 비드 세척 버퍼에서 24 시간 동안 4 ° C에서 회 전자에 유리 병을 품어. 이 시점에서, 결합 부위의 모든 잔여 단백질 비드 세척 버퍼에 포함 인간 AB 혈청에 의해 차단 될 것이다. 2 분 동안 300 XG에 구슬을 스핀 다운. 장소 유리는 2 분, 흡인 비드 세척 버퍼위한 자석에 유리 병; 자석에서 유리 병을 제거하고 PBS 1 ㎖의 솔루션을 교체합니다. 2 품질 관리, 펩타이드로드, W애싱, 저장 및 KaAPC의 안정성 FACS 튜브에 1.5 × 10 5 KaAPC를 전송하고 FACS 버퍼를 씻어 1 ㎖로 씻는다. 버퍼 및 검출 및 항 – 마우스 IgM 항체 FITC (클론 R6-60.2의 1 μL (HLA-A2-IG의 Fc 부분의 검출) 항 – 마우스의 IgG1 PE의 1 μl를 추가 워시 100 ㎕의 FACS에서 재현 탁 비즈 항 사람 CD95 단클론 항체). 버퍼 및 유동 세포 계측법에 의해 염색을 읽을 씻어 250 ㎕의 FACS 1 FACS 버퍼를 씻어 ml의 재현 탁 씻어, 4 ° C에서 15 분 동안 품어. 프로토콜 섹션에서 언급 한 바와 같이 만든 KaAPC 배치의 그림 1 QC 얼룩은. 염색은 안티 – 인간 CD95 반면, 2 HLA-A2-IG는 안티 – 마우스의 IgG1 PE 단클론 항체를 사용하여 검출 된 프로토콜 절에 설명 된대로 수행 하였다 (안티는 Fas)는 (자체 프로토콜을 참조 항 – 마우스 IgM 항체-FITC 항체로 검출되었다ction의 2.2) (파란 선). 채워진 검은 색 그래프는 각각 항 – 마우스-IgG1의 PE 단클론 항체 또는 항 – 마우스 IgM 항체 FITC 항체로 염색 빈 구슬을 나타냅니다. 오른쪽 상단 모서리에있는 숫자는 평균 형광 강도 (MFI)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 새로운 멸균 유리 병에 펩타이드로드 전송 20 × 10 6 KaAPC를 들어, 2 분 동안 자석에 배치, 5㎍을 펩타이드와 500 ㎕의 신선한 PBS로 흡인 PBS 및 재현 탁 비즈 (명심 만 HLA-A2 제한 펩타이드는 것 이량에 바인딩!). 스토어는 HLA-A2-IG 이량 체 상에 충분한 펩타이드 로딩을​​ 할 수 있도록 최소한 3 일 동안 사용할 때까지 4 ° C에서 KaAPC로드. 사용하기 직전에, 1.14에 표시된대로 KaAPC로드 펩타이드를 씻어; 이 단계에서 적어도 6 배를 반복합니다. 참고 :이 무료 펩타이드 t이 있는지 확인하는 중요한 단계이다O 위양성 죽이는 결과를 피하기 위해 완전히 제거; 잔류 자유 펩티드 항원 특이적인 T 세포 배양 9에서 아폽토시스를 유도하는 것으로 나타났다. 가용성 펩타이드의 효과를 배제하기 위해,로드 펩타이드의 상층 액을 제어 샘플을 실행하고 KaAPC을 (3.8 참조) 세척 하였다. 혈구를 사용하여 구슬을 세어 펩타이드 농도의 날짜, 이름과 레이블을 붙입니다. 참고 :로드 KaAPC 적어도 한 달 동안 4 ° C에서 작동 남아있다. 일개월 후, 동일한 펩타이드와 재로드는 KaAPC는 일년까지 활용 될 수 있습니다. 3 KaAPC 체외 죽이는 분석 공동 문화 매체를 준비합니다. 3 % 기증자자가 플라즈마 (실험실 6 제) 3 % ​​T 세포 성장 인자 보충 완료 RPMI 매체를 준비합니다. 기증자자가 혈장을 사용할 수없는 경우, 열 불 활성화 된 인간 AB 혈청을 사용합니다. AnnexinV 바인딩 버퍼 준비를 준비합니다. 8.12 g 염화나트륨 (NaCl) 및 0.12 g의 석회질을 녹여990 ML의 DDH 2에 윰 클로라이드 (염화칼슘) 10 ㎖의 1M HEPES 버퍼를 O.Add. 인간 항원 특이적인 T 세포를 생성한다. (자세한 프로토콜의 인공 항원 제시 세포 (AAPC)를 이용 이전 게시 7 참조). 그 펩타이드 특이 사량 염색에 의해 결정 적어도> 75 % 있는지 확인하십시오. 가습 인큐베이터에서 48 시간 동안 KaAPC 1 비율로 37 ℃에서 각 샘플에 대해 2 × 105 항원 특이적인 T 세포 / 웰 (96 웰 둥근 바닥 플레이트의) 하나의 공동 – 배양액 200 μL의 부화 C, 5 % CO 2. 수확 샘플 및 FACS 튜브로 전송; , 1 ㎖의 AnnexinV 결합 버퍼로 씻어 5 분 동안 300 XG에 스핀 다운, AnnexinV 결합 완충액 100 ㎕에 뜨는에 resuspend 폐기 1 μL AnnexinV FITC와 실온에서 10 ~ 15 분 동안 5 μL 7-AAD와 얼룩 샘플, 1 ml의 AnnexinV 결합 버퍼로 씻어; 5 분 동안 300 XG에 스핀 다운 뜨는 폐기250 ㎕의 AnnexinV 바인딩 버퍼의 개발에 resuspend 흐름에 즉시 샘플을 사이토 읽어보십시오. KaAPC에 의해 항원 특이적인 살해를 결정하기 위해 다음과 같은 샘플을 준비 : T 세포 만; + T 세포 용해 안티 CD95; T 세포는 KaAPC 언로드 +; + T 세포에 비 – 동족 펩티드 KaAPC로드; T 세포 + 동족 펩티드 KaAPC로드; 동족 펩티드의 T 세포 상등액 + KaAPC를 적재했다. ., CMVpp65 특정 T 세포 (~ 80 %)와 1 비율 수확 이후 AnnexinV 염색 : 그림 2 KaAPC 죽이는 분석 펩타이드는 1에서 48 시간 동안 배양 KaAPC 또는 제어 구슬 (HLA-A2-IG는 구슬) 하였다로드 및 요오드화 프로피 듐 (PI)는. 유동 세포 계측법 (참조 프로토콜 섹션 3.3-3.7)에 의해 "동족"세포 사멸을 결정이어야합니다 "비 동족"CMVpp65와 함께로드 구슬을 의미합니다마트-1 펩티드로드 광고. 숫자는 각 플롯의 왼쪽 사분면 가능한 T 세포의 비율을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. , 십자형 실험을 수행하는 두 개의 다른 특이성의 항원 특이적인 T 세포를 생성한다. 또한 이종의 T 세포 집단에서 T 세포의 항원 특이적인 제거의 동시 분석 KaAPC의 항원 특이 플리 능력을 평가한다. (자세한 프로토콜의 쉬츠 외를 참조하십시오. 10).