のライブイメージング<em>ショウジョウバエ</em>幼虫の神経芽細胞

幹細胞は、初期の開発中に、携帯多様性を生成し、成体組織に損傷を受けた細胞を置き換えるために、分化のバランスと自己再生を維持する。この恒常性の調節は損失および過剰膨張有害な組織変性又は腫瘍形成をもたらすことができる幹細胞集団の両方を防止する。

神経芽細胞（NBS）は、 ショウジョウバエの中枢神経系（ 図1A）は、胚の段階^1、2中にその第1の形態の広く研究されている神経幹細胞である。自己再生する幹細胞と分化細胞：NBには、2つの不均等運命細胞を産生する非対称細胞分裂（ACD）の反復ラウンドを受ける。 ACDは、中心体、ほとんどのセル³の微小管組織化中心として作用する非小器官膜状に案内される。有糸分裂の際に、NBの中心体は、整理し、頂端 – 基底極性に沿って双極紡錘体の向きをITY軸。除するNBの切断の際に、幹細胞の運命を指定し、頂端の運命決定因子、および分化を指定し、基礎の運命決定因子は、不均等な娘細胞に分離される。

幼虫の中央の脳では、2つのタイプのNBは、それらの数、位置、転写因子の発現、及び細胞系統（ 図^1A）4-6によって区別することができる。私のNBが最も豊富で入力して、約90それらの脳⁷の各視葉の前面及び後面を移入します。これらのNBSが転写因子Asense（ASE）を発現し、それらは特徴的に1自己再生NBに分割し、1より小さな神経母細胞（GMC、 図1B）。それぞれのGMCは、2つのニューロンまたはグリア細胞（ 図1B）を生成するために、単一の端末分裂を受ける。対照的に、各視葉の後側に移入8タイプIIのNBは、アセ発現^を欠いている^5。彼らは、ACDを受ける1自己再生NBと1の中間神経前駆（INP）を生成する。

INPは、順番に、非対称的に3〜5回に分割する。 INPの再生および単一GMC ⁴の製造におけるこれらの部 ​​門の結果の各。総称して、特定のNBのIDとGMCの誕生の時間的順序は、成人の中枢神経系の驚異的な神経細胞の多様性を生じさせる。

NB ACDが大幅生細胞イメージング技術の使用によって改善されている根底にある細胞生物学を理解する。画像のライブのNBに研究者によって使用される公開されたプロトコルは、大きく異なります。全体的に、しかしながら、これらの方法は、幼虫の脳は無傷のままか、機械的に分離されているか否かによって区別2つの一般的なカテゴリにグループ分けすることができる。両方の技術は、研究者の用途に応じて明確な利点と欠点がある。

ライブNB細胞ディビを明らかに初期の報告排出は、幼虫の脳のマニュアル解離のある程度を伴う。これらのプロトコルの詳細は^、8を塗りつけたり、カバーガラス上のNBの短期初代培養を成長させるために離れて⁹の脳をからかう。画像化を改善するために、円形のNBは、通常、ガラススライド⁸またはアガロースパッド⁹のいずれかを有するカバースリップ上に平坦化されている。扁平細胞は、光学系を改善してきたが、これらの技術は、多くの場合、分裂溝の回帰および複数回に分割することができないことを含め、NB有糸分裂の欠陥をもたらす。そのため、手動の解離と幼虫の脳組織の物理的な歪みの両方を伴うプロトコルは、一般的に非常に短期的な（ すなわち 、1細胞周期以下）用途に適しています。同様に、半退治または完全にガラススライドとカバースリップとの間で完全な脳を平坦化することは、時間1は、約30分の間¹⁰に与えられた標本を画像化過ごすことが制限されます。この制限にもかかわらず、THI複数のアプローチが成功裏に使用されてきた^11-14。

画像のライブへの最近の努力は、ニッポン放送の限界に単離された細胞の物理的な歪みを解離さ。これらの技術は、複数の細胞分裂周期のための細胞培養物を維持する必要がある用途に特に有用である。例えば、手動で解離した脳由来の分散した細胞は、部分的に、長期的画像化のための¹⁶のフィブリノーゲンおよびトロンビンの混合物¹⁵から作られた血餅中に埋め込 ​​まれてもよい。外植脳は最初の化学的酵素コラゲナーゼで解離していてもよい別の方法として、次の手動ピペットチップ繰り返し通すことによって破壊し、続いてポリ-L-リジンコートガラスボトムディッシュ^17、18上にプレー。フィブリノゲンまたはポリ-L-リジンのいずれかでガラス食器をコーティングすることは添付ファイルや主要な物理的な歪みのない、できるだけカバーガラスに近い、それらを持って来る、丸い細胞の広がりのわずかを促進する。 additi中に、これらの方法は、容易に、薬理学的摂動実験¹⁸のために交換することができる培地でのNBを培養することを含む。全体的に、直接的に分散されたNBにめっきすることは、長期的な撮像能力を犠牲にすることなく、結像光学系を改善する。最近では、解離のNBの長期培養を記述するプロトコルは¹⁹で詳述されている。

しかし、このアプローチには限界がないわけではない。のNB解離ライブイメージングには、いくつかの注意点があります。分散した細胞の分野では、例えば、それは、空間的に無傷の脳¹に編成されている特定のNB系統を識別することは困難である。同様に、タイプ解離した組織内のIIのNBに対してタイプIとを区別することは、worniu-GAL4、asense-GAL80 ²⁰などの系列のトレーサーまたはサブタイプ特異的導入遺伝子の発現なしにも困難である。これらの導入遺伝子はいくつかのアプリケーションのために非常に有用であるが、それらは、それらの導入遺伝子EXに研究者を制限しないUASエンハンサーエレメント²¹の制御の下に押されて、より複雑な遺伝的スキームを必要とする。のNBの空間的、時間的発展に関係する研究は、従って、無傷の組織の文脈におけるin vivoイメージングに必要とする。

また、解離した胚のNBの研究は、主要な極性の相間局在^22,23を決定基に隣接するセルの物理的な接触が重要であることを示している。これらの研究は完全に分離されたNBにはもはや不変紡錘体軸を維持示さない。その代わりに、これらの細胞は、よりランダム化されたスピンドル軸と根尖中心体ポジショニング²²の損失のため、おそらく、連続GMCの芽、との分離の広い角度を表示します。幼虫のNBおよびその隣接セルとの関係は広く研究されていないが、それは幼虫の幹細胞の微小環境が細胞極性又は他に衝突してもよいことを考慮する価値がある行動。幼虫のNBの生理的コンテキストを維持するために、全脳からの我々のイメージのACD。

イメージング解離したNBSで、それに関連する生来の制限を考えると、私たちの研究室などが全体の幼虫脳からNBのACDの画像連続ラウンドにプロトコルを確立しています。画像無傷の脳への技術は、多くの場合、組織の歪みや損傷を防止し、ガス交換を可能にするために、可撓性膜と培養チャンバーの一方の側のガラス表面の剛性を置き換える。いくつかの方法は、10幼虫²⁴から分離され、脂肪組織と昆虫培養培地、血清、アスコルビン酸の混合物に取り付け外植脳を伴う。それらはNB細胞の分裂^25を刺激することが知らマイトジェンを分泌するため、単離された脂肪体を添加する。このプロトコルは、3以上の時間、組織の一体性を維持し、長期的なイメージング^24、26〜28の影響を受けやすいことである。最近では、プロトコルは、経度を記述するアスコルビン酸、血清、および脂肪体の存在下で、無傷の幼虫の脳gの長期イメージングは²⁹で詳述されている。組織が ​​露出することも、固定化もされていないため、重要なのは、このアプローチは、培養培地（ 例えば 、薬剤の研究、免疫除去など ）で交換されるアプリケーションにはあまり有用である。

私たちの研究室では、長期的なイメージング^30、31、ライブ幼虫の脳の全体のマウントの準備を簡素化しました。他のものよりも我々のプロトコルの主な利点は、その単純です：我々の観察は、どちらも、血清、アスコルビン酸、インスリン、また脂肪体はNBのACDの画像連続ラウンドに必要な添加剤であることを示す。我々のイメージング媒体は、駅の単純な混合物からなるように、インスリンのような添加剤は、 ショウジョウバエ卵巣における幹細胞の分裂³²と集合細胞遊走³³の延長されたイメージングのために有用であったが、それらは、NB ACDのために不要であると思われるndard昆虫細胞培養培地は、汚染を防ぐために抗生物質 – 抗真菌を補充した。再利用可能なガス透過性又はガラス底培養皿を用いることにより、我々は連続したNB ACDの数ラウンドを持続することができた。同じ試料は、容易に外植免疫蛍光及び固定された組織との他の手順のために使用することができる。このプロトコルでは、細部そのまま幼虫の脳の解剖だけでなく、ライブおよび固定の両方の分析のための脳の準備。