Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen aus Morphologically- und neurochemisch identifizierten Hippocampus Inter
Summary
Kortikaler Netzwerke werden von einem kleinen, aber vielfältige Reihe von hemmenden Inter gesteuert. Funktionelle Untersuchung von Inter erfordert daher gezielte Aufnahme und strenge Identifizierung. Hier beschrieben wird, ist ein kombinierter Ansatz, der Ganzzellableitungen von einzelnen oder synaptisch gekoppelten Paare von Neuronen mit intrazelluläre Markierung, Post-hoc-morphologische und immunzytochemische Analyse.
Abstract
GABAergen inhibitorischen Inter spielen eine zentrale Rolle in neuronalen Schaltkreisen des Gehirns. Inter umfassen eine kleine Teilmenge der neuronalen Population (10-20%), zeigen aber eine hohe physiologische, morphologische und neurochemische Heterogenität, was ihre vielfältigen Funktionen. Daher Untersuchung von Inter bietet wichtige Einblicke in die Organisationsprinzipien und Funktion neuronaler Schaltkreise. Dies erfordert jedoch einen integrierten physiologischen und neuroanatomische Ansatz für die Auswahl und Identifizierung der einzelnen Interntypen. Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen von akuten Hirnschnitten von transgenen Tieren exprimieren fluoreszierende Proteine unter den Promotoren von Internspezifische Marker, ein effizientes Verfahren zur gezielten elektrophysiologisch zu charakterisieren intrinsischen und synaptischen Eigenschaften bestimmter Interntypen. Verbindung mit intrazellulären Farbstoff Kennzeichnung kann dieser Ansatz mit post-hoc mo verlängertrphological und immunzytochemische Analyse zur systematischen Identifizierung von aufgezeichneten Neuronen. Diese Verfahren können angepaßt werden, um eine breite Palette von wissenschaftlichen Fragen zu funktionellen Eigenschaften der verschiedenen Arten von kortikalen Neuronen entsprechen.
Introduction
Hippocampus neuronale Schaltkreise sind seit langem Gegenstand intensiver Kontrolle, sowohl in Bezug auf die Anatomie und Physiologie, die aufgrund ihrer wesentlichen Rolle bei Lernen und Gedächtnis sowie räumliche Navigation bei Mensch und Nager. Ebenso die prominenten, aber einfache laminare Organisation des Hippocampus macht diese Region zu einem beliebten Thema der Studien zu strukturellen und funktionellen Eigenschaften der kortikalen Netzwerke.
Hippocampus-Schaltungen sind von exzitatorischen Hauptzellen (> 80%) und einer kleineren (10-20%), aber sehr unterschiedliche Gruppe von hemmenden Inter 1-3 besteht. Interfrei γ-Aminobuttersäure (GABA) aus ihrer Axonterminalen, die bei schnellen ionotropen GABA A-Rezeptoren wirkt (GABA A Rs) und langsamen metabo GABA-B-Rezeptoren (GABA B Rs) 4. Diese inhibitorischen Mechanismen entgegenzuwirken Anregung und regulieren deren Erregbarkeit der Hauptzellen und damit dieir Timing und Muster der Entladung. GABA von Inter freigegeben wirkt jedoch nicht nur von den Hauptzellen, sondern auch auf die Inter sich 5,6. Pre-und postsynaptischen Rezeptoren vermitteln Feedback-Regulation und hemmenden Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Arten von Interneuron. Diese hemmenden Mechanismen im Intern Netzwerke sind vermutlich zentral für die Erzeugung und Gestaltung der Bevölkerung Aktivitätsmustern, insbesondere Schwingungen zu sein bei verschiedenen Frequenzen 7.
Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufzeichnung ist eine gut etablierte Methode für die Prüfung der Eigenschaften und der synaptischen Interaktion von Neuronen. Aufgrund der hohen Vielfalt Interntypen, die Untersuchung von hemmenden Inter erfordert jedoch strenge Identifizierung der Zellen aufgenommen. Wie Hippocampus Interntypen werden durch verschiedene morphologische Merkmale und neurochemische Marker Ausdruck, kombiniert anatomischen und immunzytochemische e gekennzeichnetxamination kann ein Mittel, um präzise Intern Identität 6,8,9 zu bestimmen.
In der vorliegenden Arbeit beschreiben wir einen experimentellen Ansatz, in der Ganzzell Patch-Clamp-Aufnahmen von einzelnen Neuronen oder synaptisch gekoppelten Paare werden mit intrazelluläre Markierung kombiniert, gefolgt von Post-hoc-morphologische und immunzytochemische Analyse, so dass für die Charakterisierung von langsam GABA B Rezeptor-vermittelte hemmende Wirkung in Inter identifiziert. Als ein Beispiel, konzentrieren wir uns auf eine wichtige Art der Intern, einer Untergruppe der so genannten "Korbzellen" (BC), die die Soma und proximalen Dendriten der postsynaptischen Zielinnerviert und wird von einem "schnellen Spick" (FS) gekennzeichnet entladen Muster, ein Axon dicht auf den Zellkörperschicht, und die Expression des Calcium-bindende Protein Parvalbumin (PV) 10,11. Diese Inter anzuzeigen große postsynaptischen inhibitorischen Ströme, sowie prominente vorgesynaptischen Modulation der synaptischen Ausgang in Reaktion auf GABA B-Aktivierung R 12. Die Kombination der hier beschriebenen Techniken können ebenso gut eingesetzt werden, um intrinsische oder synaptischen Mechanismen in einer Vielfalt von anderen identifizierten Neuron Typen zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir beschreiben eine Methode, die elektrophysiologische und neuroanatomische Techniken kombiniert, um funktionell zu charakterisieren morphologically- und neurochemisch identifizierten Neuronen in vitro; insbesondere die verschiedenen Arten von kortikalen inhibitorischen Ins. Schlüsselaspekte des Verfahrens sind: (1) Vorauswahl der potenziellen IEE; (2) die intrazelluläre Aufnahme und Neuron Visualisierung; und schließlich (3) morphologische und immunzytochemische Analyse von aufgezeichneten Ins. Obwohl diese Studie …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten sich Ina Wolter für ihre ausgezeichnete technische Unterstützung danken. VGAT-Venus transgenen Ratten wurden von Drs erzeugt. Y. Yanagawa, M. Hirabayashi und Y. in Kawaguchi Nationale Institut für Physiologische Wissenschaften, Okazaki, Japan, mit pCS2-Venus von Dr. A. Miyawaki vorgesehen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transgenic vGAT-venus rats | – | – | see Uematsu et al., 2008 |
| Venus (515 nm) goggles | BLS Ltd., Hungary | – | – |
| Dissection tools | i.e. FST | – | For brain removal |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Or other high end vibratome with minimal vertical oscillation |
| Slice holding chambers | – | – | Custom-made in lab |
| Upright IR-DIC microscope | Olympus, Japan | BX50WI | With micromanipulator system; i.e. Luigs and Neumann, Kleindiek etc. |
| CCD camera | Till Photonics | VX55 | |
| 505 nm LED system | Cairn Research | OptiLED system | Or mercury lamp or other LED system i.e. CooLED. |
| Multiclamp 700B | Axon Instruments | Alternatively 2x Axopatch 200B amplifiers | |
| WinWCP acquisition software | John Dempster, Strathclyde University | – | Any quality acquisition software could be used, i.e. EPHUS, pClamp, Igor etc. |
| Electrode Puller | Sutter | P-97 | Used with box-filament |
| Borosilicate pipette glass | Hilgenberg, Germany | 1405020 | 2 mm outer, 1 mm inner diameter, no filament |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls | Other pumps or gravity feed could be used instead |
| Digital Thermometer | – | – | Custom made |
| Digital Manometer | Supertech, Hungary | – | |
| Isolated constant voltage stimulator | Digitimer, Cambridge | DS-2A | – |
| Biocytin | Invitrogen | B1592 | Otherwise known as ε-Biotinoyl-L-Lysine |
| DL-AP5(V) disodium salt | Abcam Biochemicals | ab120271 | |
| DNQX disodium salt | Abcam Biochemicals | ab120169 | Alternatively NBQX or CNQX |
| Gabazine (SR95531) | Abcam Biochemicals | ab120042 | Alternatively bicuculline methiodide |
| R-Baclofen | Abcam Biochemicals | ab120325 | |
| CGP-55,845 hydrochloride | Tocris | 1248 | |
| Streptavidin 647 | Invitrogen | S32357 | |
| anti-PV mouse monoclonal antibody | Swant, Switzerland | 235 | Working concentration 1:5000-1:10,000 |
| anti-mouse secondary antibody | Invitrogen | A11030 | If using Venus or GFP rodent using a red-channel (i.e. 546 nm) is advisable. |
| Normal Goat Serum | Vector Labs | S-1000 | |
| Microscopy slides | – | – | Any high quality brand |
| Glass coverslips | – | – | Usually 22 x 22 mm |
| Agar spacers | – | – | Agar block, cut on vibratome to 300 μm |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus, Japan | Fluoview FV1000 | Or other comparable system |
| Fiji (Fiji is just ImageJ) | http://fiji.sc/Fiji | – | See Schindelin et al., 2012 |
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