Understanding the neural substrates of behavior requires brain circuit ensemble recording. Because of its genetic tractability, the mouse offers a model for circuit dissection and disease mimicry. Here, a method of designing and fabricating miniaturized probes is described that is suitable for targeting deep brain structure in the mouse.
Le nombre d'enquêtes physiologiques dans le muscle de souris, mus, a connu récemment une progression, parallèlement à la croissance dans les méthodes de génétique visant à microcircuit dissection et de modélisation de la maladie. L'introduction de optogénétique, par exemple, a permis pour la manipulation bidirectionnelle de neurones génétiquement identifiés, à une résolution temporelle sans précédent. Afin de capitaliser sur ces outils et mieux comprendre les interactions dynamiques entre les microcircuits du cerveau, il est essentiel que l'on a la possibilité d'enregistrer à partir d'ensembles de neurones profondément dans le cerveau de ce petit rongeur, dans les deux préparations à tête fixe et se comporter librement. Pour enregistrer à partir des structures profondes et les couches cellulaires distinctes nécessite une préparation qui permet l'avancement précis des électrodes vers les régions du cerveau souhaités. Pour enregistrer des ensembles de neurones, il est nécessaire que chaque électrode soit mobile de manière indépendante, ce qui permet à l'expérimentateur de résoudre des cellules individuelles tout en laissant Neighbélectrodes ORING perturbées. Pour cela tous les deux dans une souris comportant librement nécessite une commande d'électrode qui est léger, élastique, et hautement personnalisable pour cibler des structures cérébrales spécifiques.
Une technique pour la conception et la fabrication de miniature, poids ultra-léger, réseaux d'électrodes Microdrive qui sont personnalisables individuellement et facilement assemblé à partir de pièces disponibles dans le commerce est présenté. Ces dispositifs sont facilement évolutives et peuvent être personnalisés pour la structure étant ciblé; il a été utilisé avec succès pour enregistrer des régions thalamiques et corticales chez un animal à se comporter pendant librement comportement naturel.
Mus musculus a, en raison de sa traçabilité génétique, devenir rapidement le modèle animal de choix pour les physiologistes qui s'intéressent à niveau microcircuit dissection des neurones génétiquement identifiés et à enquêter sur des modèles murins de maladies humaines. Par exemple, l'introduction récente d'outils génétiques causales, tels que des actionneurs génétiques optogénétiques et chimiques a permis aux expérimentateurs de tester la nécessité et la suffisance des circuits neuronaux identifiés dans le comportement 1-4. La grande disponibilité des lignées transgéniques recombinants de pilote de souris Cre-(lignes), est amplifié par la simplicité expérimentale sous-types de neurones qui sont ciblées, en ajoutant à la valeur de la souris 5 pour ces expériences.
De même, les écrans génétiques et génomiques de larges associations de troubles neurologiques et psychiatriques communs ont facilité l'identification des facteurs de risque génétiques de la maladie du cerveau 6,7. Ces avancées, combinées à la cultureboîte à outils pour la manipulation génétique et l'ingénierie des génomes chez la souris, ont fait l'organisme de choix pour la modélisation des maladies humaines. La combinaison de modèles de maladies et des outils génétiques causales fournit une occasion sans précédent pour comprendre la maladie du cerveau et l'identification de cibles de niveau de circuit pour les interventions.
Pour tirer pleinement parti de ces outils moléculaires et mieux comprendre la fonction de microcircuit de la santé et de la maladie, il est essentiel de les coupler avec des lectures physiologiques de l'activité du cerveau. Idéalement, l'expérimentateur serait en mesure de surveiller un grand nombre de neurones tout en conservant la résolution de la cellule unique. Extracellulaires, des enregistrements multi-électrodes chez les animaux se comportent librement offrent cette possibilité; Cependant, l'utilisation de cette technologie dans la souris a été limitée. Pour enregistrer de petits objets (par exemple, la couche CA1 de l'hippocampe), l'utilisation d'électrodes réglables est nécessaire que les mouvements dans les électrodes d'enregistrement suivantes Surgical implantation, il est impossible de maintenir la stabilité d'enregistrement 8,9. Traditionnellement, les procédés qui ont été utilisés pour déplacer les électrodes dans le cerveau imposent des limites de poids quand il est utilisé chez la souris, ce qui rend difficile de coupler l'enregistrement d'un grand nombre de neurones ayant un comportement dans cet organisme.
Ici, les procédés sont mis en place pour la fabrication de miniatures, ultra-légers, les réseaux de microélectrodes qui sont individuellement personnalisable à la région du cerveau est ciblée, optogénétique-compatible, et assemblés à partir de pièces facilement disponibles dans le commerce. Chaque "Microdrive" dans le multi-électrode "hyperdrive" utilise un mécanisme à ressort et à vis pour faire avancer l'électrode et un rail en plastique, construit dans le corps hyperdrive, pour contrer le couple de la vis. Tout d'abord, le processus de conception des organes hyperdrive et Microdrive dans un programme de CAO pour l'impression 3D est décrite. En concevant corps hyperdrive qui sont personnaliséspour des structures particulières, il est possible d'augmenter la précision de ciblage et d'augmenter encore le rendement de la préparation. Deuxièmement, le procédé de fabrication est décrit en détail, dans lequel le réseau multi-électrode est assemblée à la main à partir de pièces qui sont disponibles dans le commerce. Cette technique a été utilisée, avec succès, pour enregistrer à partir des ensembles de neurones dans l'hippocampe, le thalamus et le cortex chez l'animal se comporter librement pendant la recherche de nourriture naturelle et tâches opérant.
Ce protocole décrit le processus de construction d'un tableau Microdrive ultra-léger pour cibler un seul ou plusieurs régions du cerveau chez la souris. Après les étapes finales de la construction, la hyperpropulseur est prête à être implantée en utilisant des techniques d'implantation chirurgicale standard et fixé sur le crâne de la souris avec du ciment dentaire. Après l'implantation, les électrodes peuvent chacun être avancé indépendamment à l'aide d'un petit tournevis, tandis que la souris est retenu par la main. La distance par tour que chaque électrode avances est déterminé par le pas de la vis. En utilisant les vis mentionnées ici avancer chaque électrode d'environ 150 mm par tour, et si la moitié quart de tour peuvent être utilisés pour une plus grande résolution.
Les dimensions de l'ébauche de la figure 1B déterminent la taille globale de l'implant, donc de manière évidente à l'échelle de façon bidirectionnelle des implants est de modifier les dimensions de ce dessin critique. De plus, elongueur e de la vis peut être étendu pour cibler des structures profondes du cerveau. Nous vous recommandons de coutume fait vis en titane, comme ceux-ci sont la lumière et moins fragile que l'acier. Notez que les rails anticouple doivent croître linéairement avec la longueur de la vis, et en ce moment nous n'avons pas déterminé la longueur maximale à laquelle ces structures peuvent être imprimés. Pour cibler plusieurs régions du cerveau, la forme de la pièce de fond peut être modifié. L'ajout de rondelles de taille connues (épaisseur 200 um), pourrait fournir des entretoises nécessaires entre les polyimides ciblant structures cérébrales distinctes (par exemple, l'hippocampe et le cortex préfrontal). Celles-ci pourraient être inclus dans les mesures de fond pièce d'assemblage, et plus tard coupés après l'époxy durcit.
Une grande limitation de cette conception est sa dépendance à l'égard des logiciels propriétaires (de Solidworks dans ce cas). Le développement futur des programmes open source qui offrent des interfaces conviviales propices à la conception de ces équipements avec un minimum de backg d'ingénierieronde serait un avantage énorme à la communauté des neurosciences.
Ce procédé présente plusieurs avantages par rapport aux méthodes existantes. Tout d'abord, le design est simple, dépend très peu de croquis (figure 1). Deuxièmement, il est ultra-léger, ne nécessitant pas de ciment dentaire ou du matériel lourd d'aller dans son ensemble. Dans l'ensemble, il pèse environ 1,7 g – près d'un tiers du poids des implants disponibles dans le commerce de fonctionnalités similaires. Troisièmement, il ne nécessite aucun équipement spécialisé à faire – le corps de l'implant peut être imprimé en 3D à partir de plusieurs sources (par exemple approto.com, mais il ya plusieurs autres); les vis peuvent être fabriqués sur mesure (par exemple antrinonline.com); les ressorts sont disponibles dans le commerce (par exemple leesprings.com); et à la suite du processus d'assemblage peut se produire en un jour. Enfin, ces implants ont été utilisés pour enregistrer à partir de plusieurs régions du cerveau au cours de la recherche de nourriture naturelle, des tâches comportementales structurées et le sommeil (figure5).
Les futures applications de cette méthode comprennent l'exécution de son évolutivité. Il est probable que l'implant peut être mis à l'échelle de façon bidirectionnelle simplement en changeant 1) la taille du schéma de la figure 1B et 2) le nombre de récipients Microdrive (Figure 1D) à motifs. Par exemple, il peut être mis à l'échelle vers le bas pour enregistrer à partir de la souris se comportent librement au début du développement, et mise à l'échelle vers le haut pour enregistrer des rats, des lapins, des furets et des primates non humains peut-être.
Un dernier mot est de rappeler au lecteur que critique de la mise en œuvre réussie de la méthode décrite est de prototyper les modifications qu'ils mettent en œuvre pour .stl fichiers de conception attachés. Le lecteur remarquera, par exemple, que la conception ci-joint contient une "figure 8" rail anti-couple. C'était la meilleure conception possible compte tenu de la limitation de l'impression 3D, comme il est souvent nécessaire que nous creusons ces trous. Avoir ce soit un cercle, ne compstabilité romise, mais avoir ce soit un carré ou une forme coudée limiterait la capacité de fixer les imperfections d'impression 3D par forage.
The authors have nothing to disclose.
We thank members of the Wilson lab for their helpful advice on the fabrication method.
This work was supported by the Simons Foundation, a NIH pathway to independence career award from the NINDS and a NARSAD Young Investigator Award (to M.M.H.) as well as grants from the NIH (to M.A.W.).
Part Name | Manufacturer | Catalogue # (if applicable) | Part Description |
Microdrive screws | Antrin | Half Circle .6UNM Titanium Screws. 8mm thread. 9mm length from under head. | |
Tap-ease | AGS CO. | #TA2 | Tapping Grease |
Microdrives | See .STL file | ||
Drive Body | See .STL file | ||
Outer Polyimide Guide Tube | Minvasive Components | IWG Item # 72113300022-012 | Length:12’’, |
ID:.0071’’, | |||
OD:.0116’’, | |||
WALL:.00225’’ | |||
Inner Polyimide Guide Tube | Minvasive Components | IWG Item # 72113900001-012 | Length: 12’’, |
ID:.0035’’, | |||
OD:.0055’’, | |||
WALL:.001’’ | |||
Grounding Wire | A-M Systems, Inc. | Catalog # 791900 | .008'' Bare, .011'' Coated |
Tri-Flow | Teflon based lubricant – Aerosol | ||
Microdrive Springs | Lee Spring | Part # CB0050B 07 E | Outside Diameter: 1.016 mm |
Hole Diameter: 1.193 mm | |||
Wire Diameter: 0.127 mm | |||
Free Length 10.160 mm | |||
Solid Length 3.581 mm | |||
Z-poxy 5 Minute | Pacer Technology (Zap) | PT37 | |
Silver Paint | GC Electronics | Part #: 22-023 | Silver Print II |
Tri-Flow | 20009 | ||
26 Gauge Hypodermic Tube – Stainless Steel | Small Parts | HTXX-26T-12-10 | Length: 12’’ |
ID: .012’’ | |||
OD: .018’’ | |||
EIB screws | Component Supply Co. | MX-0090-03SP | #00-90 x 3/16’’ |
Fine Scissors – Toughcut | Fine Science Tools | 14058-09 | 22mm |
Transparency Paper | 3M | PP2500 | |
Aluminum Foil | Reynold's Wrap Heavy Duty | Extra Thick |